Cuantificación de los efectos de los antimicrobianos en la arquitectura de biopelículas in vitro mediante el software COMSTAT
Summary
Los cambios inducidos por antimicrobianos en la arquitectura de la biopelícula de Pseudomonas aeruginosa difieren entre los aislados clínicos cultivados de pacientes con fibrosis quística e infección pulmonar crónica. Después de la microscopía confocal, el software COMSTAT se puede utilizar para cuantificar las variaciones en la arquitectura de la biopelícula (por ejemplo, área de superficie, espesor, biomasa) para aislados individuales para evaluar la eficacia de los agentes antiinfecciosos.
Abstract
Las biopelículas son agregados de microorganismos que dependen de una matriz autoproducida de sustancia polimérica extracelular para su protección e integridad estructural. Se sabe que el patógeno nosocomial, Pseudomonas aeruginosa, adopta un modo de crecimiento de biopelícula, causando infección pulmonar crónica en pacientes con fibrosis quística (FQ). El programa informático, COMSTAT, es una herramienta útil para cuantificar los cambios inducidos por antimicrobianos en la arquitectura de la biopelícula de P. aeruginosa mediante la extracción de datos de imágenes confocales tridimensionales. Sin embargo, el funcionamiento estandarizado del software se aborda con menos frecuencia, lo cual es importante para la generación óptima de informes sobre el comportamiento de la biopelícula y la comparación entre centros. Por lo tanto, el objetivo de este protocolo es proporcionar un marco simple y reproducible para cuantificar estructuras de biopelículas in vitro en diferentes condiciones antimicrobianas a través de COMSTAT. La técnica se modela utilizando un aislado de CF P. aeruginosa , cultivado en forma de réplicas de biopelícula y expuesto a tobramicina y al anticuerpo monoclonal anti-Psl, Psl0096. El enfoque paso a paso tiene como objetivo reducir la ambigüedad del usuario y minimizar la posibilidad de pasar por alto pasos cruciales del procesamiento de imágenes. Específicamente, el protocolo enfatiza la eliminación de las variaciones subjetivas asociadas con la operación manual de COMSTAT, incluida la segmentación de imágenes y la selección de funciones de análisis cuantitativo apropiadas. Aunque este método requiere que los usuarios dediquen tiempo adicional a procesar imágenes confocales antes de ejecutar COMSTAT, ayuda a minimizar la heterogenicidad de la biopelícula tergiversada en las salidas automatizadas.
Introduction
Los biofilms son agregados de microorganismos orientados en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) autoproducidas. La matriz de EPS es muy compleja y consta principalmente de células bacterianas, agua, proteínas, polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos1, todos los cuales producen biopelículas claramente diferentes de las células planctónicas de vida libre. Los EP de biofilm se adhieren entre sí y a varias superficies. La matriz de EPS tiene propiedades que median el intercambio de metabolitos de célula a célula, material genético y compuestos utilizados para la señalización y defensa intercelular2. Estas propiedades proporcionan colectivamente a las biopelículas integridad estructural y protección contra los factores estresantes externos, lo que contribuye a la evasión inmunitaria y la resistencia a los antimicrobianos3.
Pseudomonas aeruginosa es un patógeno nosocomial bien reconocido, conocido por adoptar una estrategia evasiva de crecimiento de biopelículas en respuesta a los antimicrobianos. Un buen ejemplo de esto ocurre en pacientes con el trastorno genético recesivo, la fibrosis quística (FQ). Las biopelículas desempeñan un papel fundamental en el desarrollo de P. aeruginosa resistente a los antimicrobianos 4 y permiten el establecimiento de infección pulmonar crónica en pacientes con FQ, lo que provoca un deterioro acelerado de la función pulmonar y una mortalidad prematura5. Por lo tanto, se realizan estudios de biofilm in vitro para probar la eficacia de antibióticos y nuevos agentes antiinfecciosos contra aislados de P. aeruginosa obtenidos de pacientes con FQ 6,7. Después de la formación de la biopelícula, los antimicrobianos se aplican externamente a la estructura y se utiliza la microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) para generar reconstrucciones tridimensionales de alta resolución de los segmentos de la biopelícula. Es una práctica común utilizar el software informático, COMSTAT, como complemento de ImageJ, para cuantificar los cambios en la arquitectura de la biopelícula 8,9,10,11.
Aunque COMSTAT es útil para cuantificar la estructura de la biopelícula, la reproducibilidad y la estandarización del análisis de imágenes se abordan con menos frecuencia. Por ejemplo, el procedimiento de procesamiento de imágenes, realizado antes de ejecutar COMSTAT, es objetivo, pero contiene un elemento de subjetividad al establecer umbrales de imagen12,13. De manera similar, el programa COMSTAT permite al operador elegir entre condiciones y parámetros básicos y avanzados para la segmentación de imágenes, así como diez funciones de análisis cuantitativas (por ejemplo, distribución de espesor, área de superficie, biomasa, coeficiente de rugosidad adimensional). La multitud de opciones de usuario, junto con los diferentes niveles de experiencia del operador, puede dar lugar a informes erróneos sobre el comportamiento de la biopelícula.
Por lo tanto, el objetivo de este protocolo es presentar un método relativamente sencillo para la comparación cuantitativa de estructuras de biopelículas in vitro utilizando COMSTAT. En este trabajo, se capturan imágenes tridimensionales de segmentos de biopelícula de un aislado de CF P. aeruginosa a través de CLSM utilizando el modelo14 de cubreobjetos con cámara, una técnica establecida que se utiliza para realizar experimentos de biopelícula in vitro reproducibles. Utilizando COMSTAT como un complemento de ImageJ, este método permite a los investigadores identificar cuantitativamente los cambios en la arquitectura de la biopelícula en presencia de antimicrobianos en condiciones variables. En general, este método tiene como objetivo eliminar las variaciones subjetivas asociadas con la operación manual de COMSTAT, facilitando así la estandarización de los protocolos en todos los centros.
Protocol
Representative Results
Discussion
No existe un método prescrito para comparar cuantitativamente imágenes tridimensionales de estructuras de biopelículas in vitro , y los procedimientos descritos en este contexto son a menudo difíciles de estandarizar debido a la variabilidad entre operadores20. Por lo tanto, este protocolo ofrece un marco simple y reproducible para las aplicaciones de COMSTAT que buscan cuantificar los cambios en la arquitectura de la biopelícula in vitro bajo diversas condiciones antimicrob…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a la Fundación de Fibrosis Quística por proporcionar fondos para esta investigación.
Materials
| Anti-Psl mAb, Psl0096 | Medimmune | ||
| Blood Agar (TSA with 5 % Sheep Blood) Medium | Fisher Scientific | R01200 | |
| Eight-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| Invitrogen SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Thermo Fisher Scientific | S34854 | |
| LB BROTH (LENNOX), Liquid Autoclave Sterilized | BioShop Canada | LBL666 | |
| Tobramycin, 900 µg/mg | Alfa Aesar by Thermo Fisher Scientific | J66040 | It is recommended to perform a minimal inhibitory concentration (MIC) test for every batch made to ensure quality control of antimicrobial potency |
| Quorum Volocity 6.3 | Quorum Technologies | Image analysis software |
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