Quantifizierung der Auswirkungen von Antibiotika auf die In-vitro-Biofilmarchitektur mit der COMSTAT-Software
Summary
Antimikrobiell induzierte Veränderungen der Biofilmarchitektur von Pseudomonas aeruginosa unterscheiden sich zwischen klinischen Isolaten, die von Patienten mit Mukoviszidose und chronischer Lungeninfektion kultiviert wurden. Nach der konfokalen Mikroskopie kann die COMSTAT-Software verwendet werden, um Variationen in der Biofilmarchitektur (z. B. Oberfläche, Dicke, Biomasse) für einzelne Isolate zu quantifizieren und so die Wirksamkeit von Antiinfektiva zu bewerten.
Abstract
Biofilme sind Aggregate von Mikroorganismen, die auf einer selbst produzierten Matrix aus extrazellulärer Polymersubstanz zum Schutz und zur strukturellen Integrität beruhen. Es ist bekannt, dass der nosokomiale Erreger Pseudomonas aeruginosa einen Biofilm-Wachstumsmodus annimmt, der bei Patienten mit Mukoviszidose (CF) eine chronische Lungeninfektion verursacht. Das Computerprogramm COMSTAT ist ein nützliches Werkzeug zur Quantifizierung antimikrobiell induzierter Veränderungen in der Biofilmarchitektur von P. aeruginosa , indem Daten aus dreidimensionalen konfokalen Bildern extrahiert werden. Die standardisierte Bedienung der Software wird jedoch weniger häufig angesprochen, was für eine optimale Berichterstattung über das Biofilmverhalten und einen zentrumsübergreifenden Vergleich wichtig ist. Ziel dieses Protokolls ist es daher, einen einfachen und reproduzierbaren Rahmen für die Quantifizierung von In-vitro-Biofilmstrukturen unter unterschiedlichen antimikrobiellen Bedingungen über COMSTAT bereitzustellen. Die Technik wird unter Verwendung eines CF P. aeruginosa-Isolats modelliert, das in Form von Biofilmreplikaten gezüchtet und Tobramycin und dem monoklonalen Anti-Psl-Antikörper Psl0096 ausgesetzt wurde. Der Schritt-für-Schritt-Ansatz zielt darauf ab, die Mehrdeutigkeit der Benutzer zu reduzieren und die Wahrscheinlichkeit zu minimieren, wichtige Bildverarbeitungsschritte zu übersehen. Insbesondere betont das Protokoll die Eliminierung subjektiver Variationen, die mit der manuellen Bedienung von COMSTAT verbunden sind, einschließlich der Bildsegmentierung und der Auswahl geeigneter quantitativer Analysefunktionen. Obwohl diese Methode erfordert, dass Benutzer zusätzliche Zeit für die Verarbeitung konfokaler Bilder aufwenden, bevor sie COMSTAT ausführen, hilft sie, falsch dargestellte Biofilmheterogenität in automatisierten Ausgaben zu minimieren.
Introduction
Biofilme sind Aggregate von Mikroorganismen, die in einer Matrix aus selbst produzierten extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) orientiert sind. Die EPS-Matrix ist sehr komplex und besteht hauptsächlich aus Bakterienzellen, Wasser, Proteinen, Polysacchariden, Lipiden und Nukleinsäuren1, die sich alle deutlich von freilebenden Planktonzellen unterscheiden. Biofilm-EPS haften aneinander und an verschiedenen Oberflächen. Die EPS-Matrix hat Eigenschaften, die den Zell-zu-Zell-Austausch von Metaboliten, genetischem Material und Verbindungen, die für die interzelluläre Signalübertragung und Abwehr verwendet werden, vermitteln2. Diese Eigenschaften bieten zusammen die strukturelle Integrität der Biofilme und Schutz vor äußeren Stressoren und tragen zur Immunevasion und antimikrobiellen Resistenz bei3.
Pseudomonas aeruginosa ist ein anerkannter nosokomialer Krankheitserreger, der dafür bekannt ist, als Reaktion auf antimikrobielle Mittel eine ausweichende Biofilmwachstumsstrategie zu verfolgen. Ein Paradebeispiel dafür ist bei Patienten mit der rezessiven Erbkrankheit Mukoviszidose (CF). Biofilme spielen eine zentrale Rolle bei der Entwicklung von antimikrobiell resistenten P. aeruginosa4 und ermöglichen die Etablierung einer chronischen Lungeninfektion bei Patienten mit Mukoviszidose, was zu einer beschleunigten Verschlechterung der Lungenfunktion und vorzeitiger Mortalität führt5. Daher werden In-vitro-Biofilmstudien durchgeführt, um die Wirksamkeit von Antibiotika und neuen Antiinfektiva gegen P. aeruginosa-Isolate von Patienten mit CF 6,7 zu testen. Nach der Biofilmbildung werden antimikrobielle Mittel extern auf die Struktur aufgebracht, und die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) wird verwendet, um hochauflösende, dreidimensionale Rekonstruktionen von Biofilmsegmenten zu erzeugen. Es ist üblich, dann die Computersoftware COMSTAT als Plugin für ImageJ zu verwenden, um Veränderungen in der Biofilmarchitekturzu quantifizieren 8,9,10,11.
Obwohl COMSTAT für die Quantifizierung der Biofilmstruktur nützlich ist, wird die Reproduzierbarkeit und Standardisierung der Bildanalyse weniger häufig angesprochen. So ist z. B. die Bildverarbeitung, die vor dem Ausführen von COMSTAT durchgeführt wurde, objektiv, enthält aber ein Element der Subjektivität bei der Festlegung der Bildschwellenwerte12,13. In ähnlicher Weise ermöglicht das COMSTAT-Programm dem Bediener, zwischen grundlegenden und erweiterten Bedingungen und Parametern für die Bildsegmentierung sowie zwischen zehn quantitativen Analysefunktionen (z. B. Dickenverteilung, Oberfläche, Biomasse, dimensionsloser Rauheitskoeffizient) zu wählen. Die Vielzahl der Benutzeroptionen, kombiniert mit unterschiedlichen Fachkenntnissen der Bediener, kann zu einer fehlgeleiteten Berichterstattung über das Verhalten von Biofilmen führen.
Das Ziel dieses Protokolls ist es daher, eine relativ einfache Methode zum quantitativen Vergleich von in vitro Biofilmstrukturen mit COMSTAT vorzustellen. Hierin werden dreidimensionale Bilder von Biofilmsegmenten aus einem CF P. aeruginosa-Isolat mittels CLSM unter Verwendung des kammerförmigen Deckglasmodells14 aufgenommen – einer etablierten Technik, die zur Durchführung reproduzierbarer In-vitro-Biofilmexperimente verwendet wird. Durch die Verwendung von COMSTAT als Plugin für ImageJ ermöglicht diese Methode den Forschern, Veränderungen in der Biofilmarchitektur in Gegenwart von antimikrobiellen Mitteln unter verschiedenen Bedingungen quantitativ zu identifizieren. Insgesamt zielt diese Methode darauf ab, subjektive Variationen, die mit der manuellen Bedienung von COMSTAT verbunden sind, zu eliminieren und so die Standardisierung von Protokollen über Zentren hinweg zu erleichtern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt keine vorgeschriebene Methode zum quantitativen Vergleich von dreidimensionalen Bildern von in vitro Biofilmstrukturen, und die in diesem Zusammenhang beschriebenen Verfahren sind aufgrund der Variabilität zwischen den Betreibern oft schwer zu standardisieren20. Somit bietet dieses Protokoll einen einfachen und reproduzierbaren Rahmen für COMSTAT-Anwendungen, die darauf abzielen, Veränderungen in der In-vitro-Biofilmarchitektur unter unterschiedlichen antimikrobiellen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der Cystic Fibrosis Foundation für die Finanzierung dieser Forschung.
Materials
| Anti-Psl mAb, Psl0096 | Medimmune | ||
| Blood Agar (TSA with 5 % Sheep Blood) Medium | Fisher Scientific | R01200 | |
| Eight-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| Invitrogen SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Thermo Fisher Scientific | S34854 | |
| LB BROTH (LENNOX), Liquid Autoclave Sterilized | BioShop Canada | LBL666 | |
| Tobramycin, 900 µg/mg | Alfa Aesar by Thermo Fisher Scientific | J66040 | It is recommended to perform a minimal inhibitory concentration (MIC) test for every batch made to ensure quality control of antimicrobial potency |
| Quorum Volocity 6.3 | Quorum Technologies | Image analysis software |
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