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Immunology and Infection

Quantificando os efeitos dos antimicrobianos na arquitetura de biofilme in vitro usando o software COMSTAT

Published: December 14, 2020
doi:
10.3791/61759
, , , ,
1Translational Medicine,Hospital for Sick Children, 2Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine,Hospital for Sick Children, 3Infectious Diseases, Department of Pediatrics,Hospital for Sick Children

Summary

As alterações induzidas por antimicrobianos na arquitetura do biofilme de Pseudomonas aeruginosa diferem entre os isolados clínicos cultivados de pacientes com fibrose cística e infecção pulmonar crônica. Após a microscopia confocal, o software COMSTAT pode ser utilizado para quantificar variações na arquitetura do biofilme (por exemplo, área de superfície, espessura, biomassa) para isolados individuais para avaliar a eficácia de agentes anti-infecciosos.

Abstract

Os biofilmes são agregados de microrganismos que dependem de uma matriz autoproduzida de substância polimérica extracelular para proteção e integridade estrutural. O patógeno nosocomial, Pseudomonas aeruginosa, é conhecido por adotar um modo de crescimento de biofilme, causando infecção pulmonar crônica em pacientes com fibrose cística (FC). O programa de computador, COMSTAT, é uma ferramenta útil para quantificar as mudanças induzidas por antimicrobianos na arquitetura do biofilme de P. aeruginosa , extraindo dados de imagens confocais tridimensionais. No entanto, a operação padronizada do software é menos comumente abordada, o que é importante para o relatório ideal do comportamento do biofilme e comparação entre centros. Assim, o objetivo deste protocolo é fornecer uma estrutura simples e reprodutível para quantificar estruturas de biofilme in vitro sob diferentes condições antimicrobianas via COMSTAT. A técnica é modelada usando um isolado de CF P. aeruginosa , cultivado na forma de réplicas de biofilme e exposto à tobramicina e ao anticorpo monoclonal anti-Psl, Psl0096. A abordagem passo a passo visa reduzir a ambiguidade do usuário e minimizar a chance de ignorar etapas cruciais de processamento de imagem. Especificamente, o protocolo enfatiza a eliminação de variações subjetivas associadas à operação manual do COMSTAT, incluindo segmentação de imagem e a seleção de funções de análise quantitativa apropriadas. Embora esse método exija que os usuários gastem mais tempo processando imagens confocais antes de executar o COMSTAT, ele ajuda a minimizar a heterogeneidade de biofilme deturpada em saídas automatizadas.

Introduction

Os biofilmes são agregados de microrganismos orientados em uma matriz de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) autoproduzidas. A matriz EPS é muito complexa, consistindo principalmente de células bacterianas, água, proteínas, polissacarídeos, lipídios e ácidos nucléicos1, todos os quais tornam os biofilmes distintamente diferentes das células planctônicas de vida livre. Os EPS de biofilme são aderentes uns aos outros e a várias superfícies. A matriz EPS possui propriedades que medeiam a troca célula a célula de metabólitos, material genético e compostos usados para sinalização e defesa intercelular2. Essas propriedades coletivamente fornecem integridade estrutural e proteção contra estressores externos, contribuindo para a evasão imunológica e resistência antimicrobiana3.

Pseudomonas aeruginosa é um patógeno nosocomial bem reconhecido, conhecido por adotar uma estratégia evasiva de crescimento de biofilme em resposta a antimicrobianos. Um excelente exemplo disso ocorre em pacientes com o distúrbio genético recessivo, fibrose cística (FC). Os biofilmes desempenham um papel fundamental no desenvolvimento de P. aeruginosa resistente a antimicrobianos 4 e permitem o estabelecimento de infecção pulmonar crônica em pacientes com FC, causando declínio acelerado da função pulmonar e mortalidade prematura5. Assim, estudos in vitro de biofilme são realizados para testar a eficácia de antibióticos e novos agentes anti-infecciosos contra isolados de P. aeruginosa obtidos de pacientes com FC 6,7. Após a formação do biofilme, os antimicrobianos são aplicados externamente à estrutura, e a microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) é usada para gerar reconstruções tridimensionais de alta resolução de segmentos de biofilme. É prática comum usar o software de computador, COMSTAT, como um plugin para o ImageJ, para quantificar mudanças na arquitetura do biofilme 8,9,10,11.

Embora o COMSTAT seja útil para quantificar a estrutura do biofilme, a reprodutibilidade e a padronização da análise de imagens são menos comumente abordadas. Por exemplo, o procedimento de processamento de imagem, realizado antes da execução do COMSTAT, é objetivo, mas contém um elemento de subjetividade ao definir limites de imagem12,13. De maneira semelhante, o programa COMSTAT permite que o operador escolha entre condições e parâmetros básicos a avançados para segmentação de imagens, bem como dez funções de análise quantitativa (por exemplo, distribuição de espessura, área de superfície, biomassa, coeficiente de rugosidade adimensional). A multiplicidade de opções do usuário, combinada com os diferentes níveis de experiência do operador, pode resultar em relatórios equivocados do comportamento do biofilme.

Assim, o objetivo deste protocolo é apresentar um método relativamente simples para a comparação quantitativa de estruturas de biofilme in vitro usando COMSTAT. Aqui, imagens tridimensionais de segmentos de biofilme de um isolado de CF P. aeruginosa são capturadas via CLSM usando o modelo de lamínula com câmara14 – uma técnica estabelecida usada para realizar experimentos de biofilme in vitro reprodutíveis. Utilizando o COMSTAT como um plug-in para o ImageJ, esse método permite que os pesquisadores identifiquem quantitativamente as mudanças na arquitetura do biofilme na presença de antimicrobianos sob condições variadas. No geral, esse método visa eliminar variações subjetivas associadas à operação manual do COMSTAT, facilitando assim a padronização de protocolos entre os centros.

Protocol

1. Coleta de isolados bacterianos Obtenha isolados de P. aeruginosa de uma coorte de pacientes pediátricos com FC submetidos a tratamento de erradicação com tobramicina inalada no SickKids (Toronto). Congelar isolados a -80 °C em citrato de glicerol e subcultura pelo menos três vezes antes da utilização. 2. Formação de biofilme in vitro NOTA: Use um método de lamínula com câmara1 para formação de …

Representative Results

Um isolado de P. aeruginosa cultivado de um paciente infectado com FC é usado para demonstrar os pontos fortes dessa abordagem na quantificação precisa das alterações induzidas por antimicrobianos na arquitetura do biofilme in vitro . O fluxo de trabalho geral desse modelo é representado na Figura 1. O procedimento de processamento de imagem e análise COMSTAT no ImageJ é mostrado na Figura 2. Uma abordagem simples de limite de histogram…

Discussion

Não existe um método prescrito para comparar quantitativamente imagens tridimensionais de estruturas de biofilme in vitro , e os procedimentos descritos neste contexto são muitas vezes difíceis de padronizar devido à variabilidade interoperadora20. Assim, este protocolo oferece uma estrutura simples e reprodutível para aplicações COMSTAT que buscam quantificar mudanças na arquitetura do biofilme in vitro sob diferentes condições antimicrobianas. Os pontos fortes desta …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer à Cystic Fibrosis Foundation por fornecer financiamento para esta pesquisa.

Materials

Anti-Psl mAb, Psl0096 Medimmune
Blood Agar (TSA with 5 % Sheep Blood) Medium Fisher Scientific R01200
Eight-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells Thermo Fisher Scientific 155411
Invitrogen SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain Thermo Fisher Scientific S34854
LB BROTH (LENNOX), Liquid Autoclave Sterilized BioShop Canada LBL666
Tobramycin, 900 µg/mg Alfa Aesar by Thermo Fisher Scientific J66040 It is recommended to perform a minimal inhibitory concentration (MIC) test for every batch made to ensure quality control of antimicrobial potency
Quorum Volocity 6.3 Quorum Technologies Image analysis software
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References

  1. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8, 623-633 (2010).
  2. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
  3. Rybtke, M., Hultqvist, L. D., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pseudomonas aeruginosa biofilm infections: community structure, antimicrobial tolerance and immune response. Journal of Molecular Biology. 427, 3628-3645 (2015).
  4. Wendel, A. F., Ressina, S., Kolbe-Busch, S., Pfeffer, K., MacKenzie, C. R. Species diversity of environmental GIM-1-producing bacteria collected during a long-term outbreak. Applied and Environmental Microbiology. 82, 3605-3610 (2016).
  5. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  6. Powell, L. C., et al. Targeted disruption of the extracellular polymeric network of Pseudomonas aeruginosa biofilms by alginate oligosaccharides. NPJ Biofilms and Microbiomes. 4, 1-10 (2018).
  7. Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T., Jensen, P. &. #. 2. 1. 6. ;., Wang, H., Høiby, N. Antimicrobial resistance, respiratory tract infections and role of biofilms in lung infections in cystic fibrosis patients. Advanced Drug Delivery Reviews. 85, 7-23 (2015).
  8. Landry, R. M., An, D., Hupp, J. T., Singh, P. K., Parsek, M. R. Mucin-Pseudomonas aeruginosa interactions promote biofilm formation and antibiotic resistance. Molecular Microbiology. 59, 142-151 (2006).
  9. Beaudoin, T., et al. Staphylococcus aureus interaction with Pseudomonas aeruginosa biofilm enhances tobramycin resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 3, 1-9 (2017).
  10. Rojo-Molinero, E., et al. Sequential treatment of biofilms with aztreonam and tobramycin is a novel strategy for combating Pseudomonas aeruginosa chronic respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, 2912-2922 (2016).
  11. Hentzer, M., et al. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. Journal of Bacteriology. 183, 5395-5401 (2001).
  12. Tolker-Nielsen, T., Sternberg, C. Growing and analyzing biofilms in flow chambers. Current Protocols in Microbiology. 21, 1-17 (2011).
  13. Luo, T. L., et al. A Sensitive thresholding method for confocal laser scanning microscope image stacks of microbial biofilms. Scientific Reports. 8, 1-14 (2018).
  14. Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model. Journal of Visualized Experiments. (118), e54819 (2016).
  15. DiGiandomenico, A., et al. Identification of broadly protective human antibodies to Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide Psl by phenotypic screening. Journal of Experimental Medicine. 209, 1273-1287 (2012).
  16. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
  17. Vorregaard, M. Comstat2 – a modern 3D image analysis environment for biofilms, in Informatics and Mathematical Modelling. Technical University of Denmark. , (2008).
  18. Hashemi, M. A., Khaddour, G., François, B., Massart, T. J., Salager, S. A tomographic imagery segmentation methodology for three-phase geomaterials based on simultaneous region growing. Acta Geotechnica. 9, 831-846 (2014).
  19. Rogowska, J. Overview and fundamentals of medical image segmentation. Handbook of Medical Image Processing and Analysis. , 73-90 (2009).
  20. Webb, D., et al. Assessing technician effects when extracting quantities from microscope images. Journal of Microbiological Methods. 53, 97-106 (2003).
  21. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43, 313-351 (2017).
  22. Xavier, J. B., et al. Objective threshold selection procedure (OTS) for segmentation of scanning laser confocal microscope images. Journal of Microbiological Methods. 47, 169-180 (2001).
  23. Arena, E. T., et al. Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 260 (2017).
  24. Daims, H., Wagner, M. Quantification of uncultured microorganisms by fluorescence microscopy and digital image analysis. Applied Microbiology and Biotechnology. 75, 237-248 (2007).
  25. Yerly, J., Hu, Y., Jones, S. M., Martinuzzi, R. J. A two-step procedure for automatic and accurate segmentation of volumetric CLSM biofilm images. Journal of Microbiological Methods. 70, 424-433 (2007).
  26. Lee, B., et al. Heterogeneity of biofilms formed by nonmucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5247-5255 (2005).
  27. Stapper, A. P., et al. Alginate production affects Pseudomonas aeruginosa biofilm development and architecture, but is not essential for biofilm formation. Journal of Medical Microbiology. 53, 679-690 (2004).
  28. Reichhardt, C., Parsek, M. Confocal laser scanning microscopy for analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture and matrix localization. Frontiers in Microbiology. 10, 677 (2019).
  29. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Quantifying biofilm structure using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 39, 109-119 (2000).
  30. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Evaluation of biofilm image thresholding methods. Water Research. 35, 1149-1158 (2001).
  31. Ross, S. S., et al. Quantification of confocal images of biofilms grown on irregular surfaces. Journal of Microbiological Methods. 100, 111-120 (2014).
  32. Ma, L., et al. Assembly and development of the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. PLoS Pathogens. 5, (2009).
  33. Mah, T. F., et al. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
  34. Srinandan, C. S., Jadav, V., Cecilia, D., Nerurkar, A. S. Nutrients determine the spatial architecture of Paracoccus sp. biofilm. Biofouling. 26, 449-459 (2010).
  35. Ramos, I., Dietrich, L. E., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Phenazines affect biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa in similar ways at various scales. Research in Microbiology. 161, 187-191 (2010).
  36. Ma, L., Jackson, K. D., Landry, R. M., Parsek, M. R., Wozniak, D. J. Analysis of Pseudomonas aeruginosa conditional psl variants reveals roles for the psl polysaccharide in adhesion and maintaining biofilm structure postattachment. Journal of Bacteriology. 188, 8213-8221 (2006).

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Morris, A. J., Li, A., Jackson, L., Yau, Y. C. W., Waters, V. Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software. J. Vis. Exp. (166), e61759, doi:10.3791/61759 (2020).
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