JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Kwantificering van de effecten van antimicrobiële stoffen op in vitro biofilmarchitectuur met behulp van COMSTAT-software

Published: December 14, 2020
doi:
10.3791/61759
, , , ,
1Translational Medicine,Hospital for Sick Children, 2Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine,Hospital for Sick Children, 3Infectious Diseases, Department of Pediatrics,Hospital for Sick Children

Summary

Door antimicrobiële stoffen geïnduceerde veranderingen in de biofilmarchitectuur van Pseudomonas aeruginosa verschillen tussen klinische isolaten die zijn gekweekt van patiënten met cystische fibrose en chronische longinfectie. Na confocale microscopie kan COMSTAT-software worden gebruikt om variaties in biofilmarchitectuur (bijv. oppervlakte, dikte, biomassa) voor individuele isolaten te kwantificeren om de werkzaamheid van anti-infectiemiddelen te beoordelen.

Abstract

Biofilms zijn aggregaten van micro-organismen die afhankelijk zijn van een zelfgeproduceerde matrix van extracellulaire polymere stoffen voor bescherming en structurele integriteit. Van de nosocomiale ziekteverwekker, Pseudomonas aeruginosa, is bekend dat het een biofilmgroeiwijze aanneemt, waardoor chronische longinfectie ontstaat bij patiënten met cystische fibrose (CF). Het computerprogramma COMSTAT is een nuttig hulpmiddel voor het kwantificeren van door antimicrobiële stoffen geïnduceerde veranderingen in de biofilmarchitectuur van P. aeruginosa door gegevens te extraheren uit driedimensionale confocale beelden. De gestandaardiseerde werking van de software komt echter minder vaak aan bod, wat belangrijk is voor een optimale rapportage van biofilmgedrag en vergelijking tussen centra. Het doel van dit protocol is dus om een eenvoudig en reproduceerbaar kader te bieden voor het kwantificeren van in vitro biofilmstructuren onder variërende antimicrobiële omstandigheden via COMSTAT. De techniek is gemodelleerd met behulp van een CF P. aeruginosa-isolaat , gekweekt in de vorm van biofilmreplicaten en blootgesteld aan tobramycine en het anti-Psl monoklonale antilichaam, Psl0096. De stapsgewijze aanpak is erop gericht de ambiguïteit van de gebruiker te verminderen en de kans te minimaliseren dat cruciale beeldverwerkingsstappen over het hoofd worden gezien. Het protocol legt met name de nadruk op de eliminatie van subjectieve variaties die verband houden met de handmatige bediening van COMSTAT, inclusief beeldsegmentatie en de selectie van geschikte kwantitatieve analysefuncties. Hoewel deze methode vereist dat gebruikers extra tijd besteden aan het verwerken van confocale beelden voordat COMSTAT wordt uitgevoerd, helpt het om verkeerd weergegeven biofilmheterogeniciteit in geautomatiseerde uitvoer te minimaliseren.

Introduction

Biofilms zijn aggregaten van micro-organismen die zijn georiënteerd in een matrix van zelf geproduceerde extracellulaire polymere stoffen (EPS). De EPS-matrix is zeer complex en bestaat voornamelijk uit bacteriële cellen, water, eiwitten, polysachariden, lipiden en nucleïnezuren1, die allemaal biofilms maken die duidelijk verschillen van vrijlevende planktoncellen. Biofilm EPS hechten zich aan elkaar en aan verschillende ondergronden. De EPS-matrix heeft eigenschappen die de cel-tot-cel-uitwisseling van metabolieten, genetisch materiaal en verbindingen bemiddelen die worden gebruikt voor intercellulaire signaleringen verdediging. Deze eigenschappen zorgen samen voor de structurele integriteit van biofilms en bescherming tegen externe stressoren, wat bijdraagt aan immuunontwijking en antimicrobiële resistentie3.

Pseudomonas aeruginosa is een erkende nosocomiale ziekteverwekker, waarvan bekend is dat deze een ontwijkende biofilmgroeistrategie aanneemt als reactie op antimicrobiële stoffen. Een goed voorbeeld hiervan doet zich voor bij patiënten met de recessieve genetische aandoening, cystische fibrose (CF). Biofilms spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling van antimicrobieel resistente P. aeruginosa4 en maken het mogelijk om chronische longinfectie vast te stellen bij patiënten met CF, wat leidt tot versnelde achteruitgang van de longfunctie en vroegtijdige sterfte5. Daarom worden in vitro biofilmstudies uitgevoerd om de werkzaamheid van antibiotica en nieuwe anti-infectieuze middelen tegen P. aeruginosa-isolaten te testen die zijn verkregen van patiënten met CF 6,7. Na de vorming van biofilm worden antimicrobiële stoffen uitwendig op de structuur aangebracht en wordt confocale laserscanmicroscopie (CLSM) gebruikt om driedimensionale reconstructies met hoge resolutie van biofilmsegmenten te genereren. Het is gebruikelijk om vervolgens de computersoftware, COMSTAT, te gebruiken als een plug-in voor ImageJ, om veranderingen in de biofilmarchitectuur te kwantificeren 8,9,10,11.

Hoewel COMSTAT nuttig is voor het kwantificeren van de biofilmstructuur, wordt de reproduceerbaarheid en standaardisatie van beeldanalyse minder vaak aangepakt. De beeldverwerkingsprocedure, die wordt uitgevoerd voordat COMSTAT wordt uitgevoerd, is objectief, maar bevat een element van subjectiviteit bij het instellen van beelddrempels12,13. Op dezelfde manier stelt het COMSTAT-programma de operator in staat om te kiezen uit basis- tot geavanceerde voorwaarden en parameters voor beeldsegmentatie, evenals tien kwantitatieve analysefuncties (bijv. dikteverdeling, oppervlakte, biomassa, dimensieloze ruwheidscoëfficiënt). De veelheid aan gebruikersopties, gecombineerd met verschillende expertiseniveaus van de operator, kan leiden tot misleidende rapportage van biofilmgedrag.

Het doel van dit protocol is dus om een relatief eenvoudige methode te presenteren voor de kwantitatieve vergelijking van in vitro biofilmstructuren met behulp van COMSTAT. Hierin worden driedimensionale beelden van biofilmsegmenten van een CF P. aeruginosa-isolaat vastgelegd via CLSM met behulp van het kamermodel14 – een gevestigde techniek die wordt gebruikt om reproduceerbare in vitro biofilmexperimenten uit te voeren. Door gebruik te maken van COMSTAT als een plug-in voor ImageJ, stelt deze methode onderzoekers in staat om veranderingen in de biofilmarchitectuur in aanwezigheid van antimicrobiële stoffen onder verschillende omstandigheden kwantitatief te identificeren. Over het algemeen is deze methode bedoeld om subjectieve variaties te elimineren die verband houden met de handmatige bediening van COMSTAT, waardoor de standaardisatie van protocollen in verschillende centra wordt vergemakkelijkt.

Protocol

1. Verzameling van bacterie-isolaten Verkrijg P. aeruginosa-isolaten van een cohort pediatrische patiënten met CF die een uitroeiingsbehandeling ondergaan met inhalatietobramycine bij SickKids (Toronto). Vriesisolaten voor gebruik minstens drie keer in bij -80 °C in glycerolcitraat en subcultuur. 2. In vitro biofilmvorming OPMERKING: Gebruik een kamerbedekglas methode1 voor in vitro biofilmvorming me…

Representative Results

Een P. aeruginosa-isolaat gekweekt uit een geïnfecteerde patiënt met CF wordt gebruikt om de sterke punten van deze benadering aan te tonen bij het nauwkeurig kwantificeren van door antimicrobieel geïnduceerde veranderingen in in vitro biofilmarchitectuur. De algehele workflow van dit model is weergegeven in figuur 1. De procedure voor beeldverwerking en COMSTAT-analyse in ImageJ is weergegeven in figuur 2. Een eenvoudige histogramdrempelben…

Discussion

Er is geen voorgeschreven methode voor het kwantitatief vergelijken van driedimensionale beelden van in vitro biofilmstructuren, en procedures die in deze context worden beschreven, zijn vaak moeilijk te standaardiseren vanwege de variabiliteit tussen de operators20. Dit protocol biedt dus een eenvoudig en reproduceerbaar raamwerk voor COMSTAT-toepassingen die veranderingen in de in vitro biofilmarchitectuur onder verschillende antimicrobiële omstandigheden willen kwantificeren….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen de Cystic Fibrosis Foundation bedanken voor het financieren van dit onderzoek.

Materials

Anti-Psl mAb, Psl0096 Medimmune
Blood Agar (TSA with 5 % Sheep Blood) Medium Fisher Scientific R01200
Eight-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells Thermo Fisher Scientific 155411
Invitrogen SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain Thermo Fisher Scientific S34854
LB BROTH (LENNOX), Liquid Autoclave Sterilized BioShop Canada LBL666
Tobramycin, 900 µg/mg Alfa Aesar by Thermo Fisher Scientific J66040 It is recommended to perform a minimal inhibitory concentration (MIC) test for every batch made to ensure quality control of antimicrobial potency
Quorum Volocity 6.3 Quorum Technologies Image analysis software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8, 623-633 (2010).
  2. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
  3. Rybtke, M., Hultqvist, L. D., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pseudomonas aeruginosa biofilm infections: community structure, antimicrobial tolerance and immune response. Journal of Molecular Biology. 427, 3628-3645 (2015).
  4. Wendel, A. F., Ressina, S., Kolbe-Busch, S., Pfeffer, K., MacKenzie, C. R. Species diversity of environmental GIM-1-producing bacteria collected during a long-term outbreak. Applied and Environmental Microbiology. 82, 3605-3610 (2016).
  5. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  6. Powell, L. C., et al. Targeted disruption of the extracellular polymeric network of Pseudomonas aeruginosa biofilms by alginate oligosaccharides. NPJ Biofilms and Microbiomes. 4, 1-10 (2018).
  7. Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T., Jensen, P. &. #. 2. 1. 6. ;., Wang, H., Høiby, N. Antimicrobial resistance, respiratory tract infections and role of biofilms in lung infections in cystic fibrosis patients. Advanced Drug Delivery Reviews. 85, 7-23 (2015).
  8. Landry, R. M., An, D., Hupp, J. T., Singh, P. K., Parsek, M. R. Mucin-Pseudomonas aeruginosa interactions promote biofilm formation and antibiotic resistance. Molecular Microbiology. 59, 142-151 (2006).
  9. Beaudoin, T., et al. Staphylococcus aureus interaction with Pseudomonas aeruginosa biofilm enhances tobramycin resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 3, 1-9 (2017).
  10. Rojo-Molinero, E., et al. Sequential treatment of biofilms with aztreonam and tobramycin is a novel strategy for combating Pseudomonas aeruginosa chronic respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, 2912-2922 (2016).
  11. Hentzer, M., et al. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. Journal of Bacteriology. 183, 5395-5401 (2001).
  12. Tolker-Nielsen, T., Sternberg, C. Growing and analyzing biofilms in flow chambers. Current Protocols in Microbiology. 21, 1-17 (2011).
  13. Luo, T. L., et al. A Sensitive thresholding method for confocal laser scanning microscope image stacks of microbial biofilms. Scientific Reports. 8, 1-14 (2018).
  14. Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model. Journal of Visualized Experiments. (118), e54819 (2016).
  15. DiGiandomenico, A., et al. Identification of broadly protective human antibodies to Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide Psl by phenotypic screening. Journal of Experimental Medicine. 209, 1273-1287 (2012).
  16. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
  17. Vorregaard, M. Comstat2 – a modern 3D image analysis environment for biofilms, in Informatics and Mathematical Modelling. Technical University of Denmark. , (2008).
  18. Hashemi, M. A., Khaddour, G., François, B., Massart, T. J., Salager, S. A tomographic imagery segmentation methodology for three-phase geomaterials based on simultaneous region growing. Acta Geotechnica. 9, 831-846 (2014).
  19. Rogowska, J. Overview and fundamentals of medical image segmentation. Handbook of Medical Image Processing and Analysis. , 73-90 (2009).
  20. Webb, D., et al. Assessing technician effects when extracting quantities from microscope images. Journal of Microbiological Methods. 53, 97-106 (2003).
  21. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43, 313-351 (2017).
  22. Xavier, J. B., et al. Objective threshold selection procedure (OTS) for segmentation of scanning laser confocal microscope images. Journal of Microbiological Methods. 47, 169-180 (2001).
  23. Arena, E. T., et al. Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 260 (2017).
  24. Daims, H., Wagner, M. Quantification of uncultured microorganisms by fluorescence microscopy and digital image analysis. Applied Microbiology and Biotechnology. 75, 237-248 (2007).
  25. Yerly, J., Hu, Y., Jones, S. M., Martinuzzi, R. J. A two-step procedure for automatic and accurate segmentation of volumetric CLSM biofilm images. Journal of Microbiological Methods. 70, 424-433 (2007).
  26. Lee, B., et al. Heterogeneity of biofilms formed by nonmucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5247-5255 (2005).
  27. Stapper, A. P., et al. Alginate production affects Pseudomonas aeruginosa biofilm development and architecture, but is not essential for biofilm formation. Journal of Medical Microbiology. 53, 679-690 (2004).
  28. Reichhardt, C., Parsek, M. Confocal laser scanning microscopy for analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture and matrix localization. Frontiers in Microbiology. 10, 677 (2019).
  29. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Quantifying biofilm structure using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 39, 109-119 (2000).
  30. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Evaluation of biofilm image thresholding methods. Water Research. 35, 1149-1158 (2001).
  31. Ross, S. S., et al. Quantification of confocal images of biofilms grown on irregular surfaces. Journal of Microbiological Methods. 100, 111-120 (2014).
  32. Ma, L., et al. Assembly and development of the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. PLoS Pathogens. 5, (2009).
  33. Mah, T. F., et al. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
  34. Srinandan, C. S., Jadav, V., Cecilia, D., Nerurkar, A. S. Nutrients determine the spatial architecture of Paracoccus sp. biofilm. Biofouling. 26, 449-459 (2010).
  35. Ramos, I., Dietrich, L. E., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Phenazines affect biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa in similar ways at various scales. Research in Microbiology. 161, 187-191 (2010).
  36. Ma, L., Jackson, K. D., Landry, R. M., Parsek, M. R., Wozniak, D. J. Analysis of Pseudomonas aeruginosa conditional psl variants reveals roles for the psl polysaccharide in adhesion and maintaining biofilm structure postattachment. Journal of Bacteriology. 188, 8213-8221 (2006).

Tags

BiofilmAntimicrobialPseudomonas AeruginosaCOMSTATCystic FibrosisTobramycinAnti-Psl Monoclonal AntibodyImage SegmentationBiofilm ArchitectureConfocal Microscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Morris, A. J., Li, A., Jackson, L., Yau, Y. C. W., Waters, V. Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software. J. Vis. Exp. (166), e61759, doi:10.3791/61759 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image