JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

כימות ההשפעות של אנטי-מיקרוביאלים על ארכיטקטורת ביופילם במבחנה באמצעות תוכנת COMSTAT

Published: December 14, 2020
doi:
10.3791/61759
, , , ,
1Translational Medicine,Hospital for Sick Children, 2Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine,Hospital for Sick Children, 3Infectious Diseases, Department of Pediatrics,Hospital for Sick Children

Summary

שינויים אנטי-מיקרוביאליים בארכיטקטורת הביופילם Pseudomonas aeruginosa שונים בין מבודדים קליניים שגודלו בתרבית מחולים עם סיסטיק פיברוזיס וזיהום ריאתי כרוני. לאחר מיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן להשתמש בתוכנת COMSTAT כדי לכמת וריאציות בארכיטקטורת ביופילם (למשל, שטח פנים, עובי, ביומסה) עבור מבודדים בודדים כדי להעריך את היעילות של חומרים אנטי זיהומיים.

Abstract

ביופילמים הם אגרגטים של מיקרואורגניזמים המסתמכים על מטריצה בייצור עצמי של חומר פולימרי חוץ-תאי להגנה ולשלמות מבנית. הפתוגן הנוזוקומיאלי, Pseudomonas aeruginosa, ידוע כמאמץ מצב גידול ביופילם, הגורם לזיהום ריאתי כרוני בחולים עם סיסטיק פיברוזיס (CF). תוכנת המחשב, COMSTAT, היא כלי שימושי לכימות שינויים אנטי-מיקרוביאליים בארכיטקטורת הביופילם P . aeruginosa על ידי חילוץ נתונים מתמונות קונפוקליות תלת-ממדיות. עם זאת, פעולה סטנדרטית של התוכנה פחות נפוצה, וזה חשוב לדיווח אופטימלי של התנהגות ביופילם והשוואה בין מרכזים. לפיכך, מטרת פרוטוקול זה היא לספק מסגרת פשוטה וניתנת לשחזור לכימות מבני ביופילם במבחנה בתנאים אנטי-מיקרוביאליים משתנים באמצעות COMSTAT. הטכניקה מעוצבת באמצעות CF P. aeruginosa מבודד, גדל בצורה של שכפול ביופילם, ונחשף לטוברמיצין ולנוגדן החד-שבטי נגד Psl, Psl0096. הגישה שלב אחר שלב שואפת להפחית את העמימות של המשתמשים ולמזער את הסיכוי להתעלם משלבים קריטיים של עיבוד תמונה. באופן ספציפי, הפרוטוקול מדגיש את חיסול וריאציות סובייקטיביות הקשורות לפעולה הידנית של COMSTAT, כולל פילוח תמונה ובחירת פונקציות ניתוח כמותיות מתאימות. למרות ששיטה זו דורשת מהמשתמשים להשקיע זמן נוסף בעיבוד תמונות קונפוקליות לפני הפעלת COMSTAT, היא מסייעת למזער הטרוגניות של ביופילם במצג שווא בפלטים אוטומטיים.

Introduction

ביופילמים הם צברים של מיקרואורגניזמים המכוונים במטריצה של חומרים פולימריים חוץ-תאיים המיוצרים בייצור עצמי (EPS). מטריצת EPS מורכבת מאוד, ומורכבת בעיקר מתאי חיידקים, מים, חלבונים, רב-סוכרים, ליפידים וחומצות גרעין1, שכולם יוצרים ביופילמים שונים באופן מובהק מתאים פלנקטוניים חופשיים. ביופילם EPS דבקים זה בזה ומשטחים שונים. למטריצת EPS תכונות המתווכות חילופי מטבוליטים, חומרים גנטיים ותרכובות המשמשות לאיתות והגנה בין-תאיים2. תכונות אלה יחד מספקות לביופילמים שלמות מבנית והגנה מפני גורמי עקה חיצוניים, ותורמות להתחמקות חיסונית ולעמידות מיקרוביאלית3.

Pseudomonas aeruginosa הוא פתוגן נוסוקומיאלי מוכר היטב, הידוע כמאמץ אסטרטגיית גידול ביופילם מתחמקת בתגובה לאנטי-מיקרוביאליים. דוגמה מצוינת לכך מתרחשת בחולים עם הפרעה גנטית רצסיבית, סיסטיק פיברוזיס (CF). ביופילמים ממלאים תפקיד מרכזי בהתפתחות P. aeruginosa4 עמיד לחיידקים ומאפשרים התבססות של זיהום ריאתי כרוני בחולים עם CF, הגורם לירידה מואצת בתפקוד הריאות ולתמותה מוקדמת5. לפיכך, מחקרי ביופילם במבחנה מבוצעים כדי לבחון את היעילות של אנטיביוטיקה וחומרים אנטי זיהומיים חדשים נגד מבודדי P. aeruginosa המתקבלים מחולים עם CF 6,7. לאחר היווצרות ביופילם, אנטי-מיקרוביאלים מיושמים חיצונית על המבנה, ומיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) משמש ליצירת שחזורים תלת-ממדיים ברזולוציה גבוהה של מקטעי ביופילם. לאחר מכן מקובל להשתמש בתוכנת המחשב, COMSTAT, כתוסף ל-ImageJ, כדי לכמת שינויים בארכיטקטורת ביופילם 8,9,10,11.

למרות ש- COMSTAT שימושי לכימות מבנה הביופילם, השכפול והסטנדרטיזציה של ניתוח תמונות פחות נפוצים. לדוגמה, הליך עיבוד התמונה, המבוצע לפני הפעלת COMSTAT, הוא אובייקטיבי, אך מכיל אלמנט של סובייקטיביות בעת הגדרת ספי תמונה12,13. באופן דומה, תוכנית COMSTAT מאפשרת למפעיל לבחור בין תנאים ופרמטרים בסיסיים למתקדמים עבור פילוח תמונה וכן עשר פונקציות ניתוח כמותיות (למשל, התפלגות עובי, שטח פנים, ביומסה, מקדם חספוס חסר ממד). ריבוי אפשרויות המשתמש, בשילוב עם רמות מומחיות שונות של המפעילים, עלול לגרום לדיווח מוטעה על התנהגות ביופילם.

לפיכך, מטרת פרוטוקול זה היא להציג שיטה פשוטה יחסית להשוואה כמותית של מבני ביופילם במבחנה באמצעות COMSTAT. כאן, תמונות תלת-ממדיות של מקטעי ביופילם מבודד CF P. aeruginosa מצולמות באמצעות CLSM באמצעות דגם זכוכית כיסוי תא14 – טכניקה מבוססת המשמשת לביצוע ניסויי ביופילם הניתנים לשחזור במבחנה . באמצעות COMSTAT כתוסף ל-ImageJ, שיטה זו מאפשרת לחוקרים לזהות באופן כמותי שינויים בארכיטקטורת הביופילם בנוכחות אנטי-מיקרוביאלים בתנאים משתנים. בסך הכל, שיטה זו שואפת לבטל וריאציות סובייקטיביות הקשורות לפעולה הידנית של COMSTAT, ובכך להקל על סטנדרטיזציה של פרוטוקולים בין מרכזים.

Protocol

1. איסוף חיידקים מבודדים קבל P. aeruginosa מבודד מקבוצה של חולים ילדים עם CF שעברו טיפול מיגור עם tobramycin בשאיפה ב SickKids (טורונטו). יש להקפיא מבודד בטמפרטורה של -80°C בגליצרול ציטראט ובתת-תרבית לפחות שלוש פעמים לפני השימוש. 2. היווצרות ביופילם במבחנה הערה: …

Representative Results

מבודד P. aeruginosa בתרבית מחולה נגוע ב- CF משמש כדי להדגים את נקודות החוזק של גישה זו בכימות מדויק של שינויים הנגרמים על ידי מיקרוביאלית בארכיטקטורה של ביופילם במבחנה . זרימת העבודה הכוללת של מודל זה מיוצגת באיור 1. תהליך עיבוד התמונה וניתוח COMSTAT ב-ImageJ מוצג בא?…

Discussion

אין שיטה קבועה להשוואה כמותית של תמונות תלת-ממדיות של מבני ביופילם במבחנה , ולעתים קרובות קשה לתקנן הליכים המתוארים בהקשר זה בשל שונות בין-אופרטורית20. לפיכך, פרוטוקול זה מציע מסגרת פשוטה וניתנת לשחזור עבור יישומי COMSTAT המבקשים לכמת שינויים בארכיטקטורת ביופילם במבחנה…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לקרן סיסטיק פיברוזיס על מתן המימון למחקר זה.

Materials

Anti-Psl mAb, Psl0096 Medimmune
Blood Agar (TSA with 5 % Sheep Blood) Medium Fisher Scientific R01200
Eight-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells Thermo Fisher Scientific 155411
Invitrogen SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain Thermo Fisher Scientific S34854
LB BROTH (LENNOX), Liquid Autoclave Sterilized BioShop Canada LBL666
Tobramycin, 900 µg/mg Alfa Aesar by Thermo Fisher Scientific J66040 It is recommended to perform a minimal inhibitory concentration (MIC) test for every batch made to ensure quality control of antimicrobial potency
Quorum Volocity 6.3 Quorum Technologies Image analysis software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8, 623-633 (2010).
  2. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
  3. Rybtke, M., Hultqvist, L. D., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pseudomonas aeruginosa biofilm infections: community structure, antimicrobial tolerance and immune response. Journal of Molecular Biology. 427, 3628-3645 (2015).
  4. Wendel, A. F., Ressina, S., Kolbe-Busch, S., Pfeffer, K., MacKenzie, C. R. Species diversity of environmental GIM-1-producing bacteria collected during a long-term outbreak. Applied and Environmental Microbiology. 82, 3605-3610 (2016).
  5. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  6. Powell, L. C., et al. Targeted disruption of the extracellular polymeric network of Pseudomonas aeruginosa biofilms by alginate oligosaccharides. NPJ Biofilms and Microbiomes. 4, 1-10 (2018).
  7. Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T., Jensen, P. &. #. 2. 1. 6. ;., Wang, H., Høiby, N. Antimicrobial resistance, respiratory tract infections and role of biofilms in lung infections in cystic fibrosis patients. Advanced Drug Delivery Reviews. 85, 7-23 (2015).
  8. Landry, R. M., An, D., Hupp, J. T., Singh, P. K., Parsek, M. R. Mucin-Pseudomonas aeruginosa interactions promote biofilm formation and antibiotic resistance. Molecular Microbiology. 59, 142-151 (2006).
  9. Beaudoin, T., et al. Staphylococcus aureus interaction with Pseudomonas aeruginosa biofilm enhances tobramycin resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 3, 1-9 (2017).
  10. Rojo-Molinero, E., et al. Sequential treatment of biofilms with aztreonam and tobramycin is a novel strategy for combating Pseudomonas aeruginosa chronic respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, 2912-2922 (2016).
  11. Hentzer, M., et al. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. Journal of Bacteriology. 183, 5395-5401 (2001).
  12. Tolker-Nielsen, T., Sternberg, C. Growing and analyzing biofilms in flow chambers. Current Protocols in Microbiology. 21, 1-17 (2011).
  13. Luo, T. L., et al. A Sensitive thresholding method for confocal laser scanning microscope image stacks of microbial biofilms. Scientific Reports. 8, 1-14 (2018).
  14. Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model. Journal of Visualized Experiments. (118), e54819 (2016).
  15. DiGiandomenico, A., et al. Identification of broadly protective human antibodies to Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide Psl by phenotypic screening. Journal of Experimental Medicine. 209, 1273-1287 (2012).
  16. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
  17. Vorregaard, M. Comstat2 – a modern 3D image analysis environment for biofilms, in Informatics and Mathematical Modelling. Technical University of Denmark. , (2008).
  18. Hashemi, M. A., Khaddour, G., François, B., Massart, T. J., Salager, S. A tomographic imagery segmentation methodology for three-phase geomaterials based on simultaneous region growing. Acta Geotechnica. 9, 831-846 (2014).
  19. Rogowska, J. Overview and fundamentals of medical image segmentation. Handbook of Medical Image Processing and Analysis. , 73-90 (2009).
  20. Webb, D., et al. Assessing technician effects when extracting quantities from microscope images. Journal of Microbiological Methods. 53, 97-106 (2003).
  21. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43, 313-351 (2017).
  22. Xavier, J. B., et al. Objective threshold selection procedure (OTS) for segmentation of scanning laser confocal microscope images. Journal of Microbiological Methods. 47, 169-180 (2001).
  23. Arena, E. T., et al. Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 260 (2017).
  24. Daims, H., Wagner, M. Quantification of uncultured microorganisms by fluorescence microscopy and digital image analysis. Applied Microbiology and Biotechnology. 75, 237-248 (2007).
  25. Yerly, J., Hu, Y., Jones, S. M., Martinuzzi, R. J. A two-step procedure for automatic and accurate segmentation of volumetric CLSM biofilm images. Journal of Microbiological Methods. 70, 424-433 (2007).
  26. Lee, B., et al. Heterogeneity of biofilms formed by nonmucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5247-5255 (2005).
  27. Stapper, A. P., et al. Alginate production affects Pseudomonas aeruginosa biofilm development and architecture, but is not essential for biofilm formation. Journal of Medical Microbiology. 53, 679-690 (2004).
  28. Reichhardt, C., Parsek, M. Confocal laser scanning microscopy for analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture and matrix localization. Frontiers in Microbiology. 10, 677 (2019).
  29. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Quantifying biofilm structure using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 39, 109-119 (2000).
  30. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Evaluation of biofilm image thresholding methods. Water Research. 35, 1149-1158 (2001).
  31. Ross, S. S., et al. Quantification of confocal images of biofilms grown on irregular surfaces. Journal of Microbiological Methods. 100, 111-120 (2014).
  32. Ma, L., et al. Assembly and development of the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. PLoS Pathogens. 5, (2009).
  33. Mah, T. F., et al. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
  34. Srinandan, C. S., Jadav, V., Cecilia, D., Nerurkar, A. S. Nutrients determine the spatial architecture of Paracoccus sp. biofilm. Biofouling. 26, 449-459 (2010).
  35. Ramos, I., Dietrich, L. E., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Phenazines affect biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa in similar ways at various scales. Research in Microbiology. 161, 187-191 (2010).
  36. Ma, L., Jackson, K. D., Landry, R. M., Parsek, M. R., Wozniak, D. J. Analysis of Pseudomonas aeruginosa conditional psl variants reveals roles for the psl polysaccharide in adhesion and maintaining biofilm structure postattachment. Journal of Bacteriology. 188, 8213-8221 (2006).

Tags

BiofilmAntimicrobialPseudomonas AeruginosaCOMSTATCystic FibrosisTobramycinAnti-Psl Monoclonal AntibodyImage SegmentationBiofilm ArchitectureConfocal Microscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Morris, A. J., Li, A., Jackson, L., Yau, Y. C. W., Waters, V. Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software. J. Vis. Exp. (166), e61759, doi:10.3791/61759 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image