القياس الكمي لآثار مضادات الميكروبات على بنية الأغشية الحيوية في المختبر باستخدام برمجيات COMSTAT
Summary
تختلف التغيرات التي تسببها مضادات الميكروبات في بنية الأغشية الحيوية Pseudomonas aeruginosa بين العزلات السريرية المستزرعة من المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي والعدوى الرئوية المزمنة. بعد الفحص المجهري متحد البؤر ، يمكن استخدام برنامج COMSTAT لتحديد الاختلافات في بنية الأغشية الحيوية (على سبيل المثال ، مساحة السطح ، السمك ، الكتلة الحيوية) للعزلات الفردية لتقييم فعالية العوامل المضادة للعدوى.
Abstract
الأغشية الحيوية هي مجاميع من الكائنات الحية الدقيقة التي تعتمد على مصفوفة منتجة ذاتيا من مادة بوليمرية خارج الخلية للحماية والسلامة الهيكلية. من المعروف أن العامل الممرض في المستشفيات ، Pseudomonas aeruginosa ، يتبنى وضع نمو الأغشية الحيوية ، مما يسبب عدوى رئوية مزمنة في مرضى التليف الكيسي (CF). والبرنامج الحاسوبي COMSTAT أداة مفيدة لقياس التغيرات التي تسببها مضادات الميكروبات في بنية الأغشية الحيوية P. aeruginosa عن طريق استخراج البيانات من الصور ثلاثية البؤر البؤرية. ومع ذلك ، فإن التشغيل الموحد للبرنامج أقل شيوعا ، وهو أمر مهم للإبلاغ الأمثل عن سلوك الأغشية الحيوية والمقارنة عبر المراكز. وبالتالي ، فإن الهدف من هذا البروتوكول هو توفير إطار بسيط وقابل للتكرار لقياس هياكل الأغشية الحيوية في المختبر في ظل ظروف مختلفة مضادة للميكروبات عبر COMSTAT. تم تصميم هذه التقنية باستخدام عزل CF P. aeruginosa ، الذي ينمو في شكل نسخ بيوفيلم مكرر ، ويتعرض للتوبراميسين والجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل Psl ، Psl0096. يهدف النهج التدريجي إلى تقليل غموض المستخدم وتقليل فرصة تجاهل خطوات معالجة الصور الحاسمة. وعلى وجه التحديد، يشدد البروتوكول على إزالة الاختلافات الذاتية المرتبطة بالتشغيل اليدوي للقاعدة الإحصائية للقاعدة الإحصائية (COMSTAT)، بما في ذلك تجزئة الصور واختيار وظائف التحليل الكمي المناسبة. على الرغم من أن هذه الطريقة تتطلب من المستخدمين قضاء وقت إضافي في معالجة الصور متحدة البؤر قبل تشغيل COMSTAT ، إلا أنها تساعد على تقليل عدم تجانس الأغشية الحيوية المشوهة في المخرجات الآلية.
Introduction
الأغشية الحيوية هي مجاميع من الكائنات الحية الدقيقة الموجهة في مصفوفة من المواد البوليمرية خارج الخلية المنتجة ذاتيا (EPS). مصفوفة EPS معقدة للغاية ، وتتكون بشكل أساسي من الخلايا البكتيرية والماء والبروتينات والسكريات والدهون والأحماض النووية1 ، وكلها تجعل الأغشية الحيوية مختلفة بشكل واضح عن خلايا العوالق الحية الحرة. Biofilm EPS ملتصقة ببعضها البعض والأسطح المختلفة. تتميز مصفوفة EPS بخصائص تتوسط التبادل من خلية إلى خلية للمستقلبات والمواد الوراثية والمركبات المستخدمة في الإشارات والدفاع بين الخلايا2. توفر هذه الخصائص مجتمعة السلامة الهيكلية للأغشية الحيوية والحماية ضد الضغوطات الخارجية ، مما يساهم في التهرب المناعي ومقاومة مضادات الميكروبات3.
Pseudomonas aeruginosa هو أحد مسببات الأمراض المعترف بها جيدا في المستشفيات ، والمعروف أنه يتبنى استراتيجية نمو الأغشية الحيوية المراوغة استجابة لمضادات الميكروبات. مثال رئيسي على ذلك يحدث في المرضى الذين يعانون من الاضطراب الوراثي المتنحي ، التليف الكيسي (CF). تلعب الأغشية الحيوية دورا محوريا في تطوير P. aeruginosa4 المقاوم لمضادات الميكروبات وتسمح بإنشاء عدوى رئوية مزمنة في مرضى التليف الكيسي ، مما يتسبب في انخفاض متسارع في وظائف الرئة والوفيات المبكرة5. ومن ثم ، يتم إجراء دراسات الأغشية الحيوية في المختبر لاختبار فعالية المضادات الحيوية والعوامل الجديدة المضادة للعدوى ضد عزلات P. aeruginosa التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من CF 6,7. بعد تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة ، يتم تطبيق مضادات الميكروبات خارجيا على الهيكل ، ويتم استخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM) لتوليد عمليات إعادة بناء عالية الدقة وثلاثية الأبعاد لشرائح الأغشية الحيوية. من الممارسات الشائعة استخدام برنامج الكمبيوتر ، COMSTAT ، كمكون إضافي ل ImageJ ، لتحديد التغييرات في بنية الأغشية الحيوية8،9،10،11.
وعلى الرغم من أن الكومستات مفيد في القياس الكمي لبنية الأغشية الحيوية، فإن قابلية استنساخ تحليل الصور وتوحيدها أقل شيوعا. على سبيل المثال ، إجراء معالجة الصور ، الذي تم إجراؤه قبل تشغيل COMSTAT ، موضوعي ، ولكنه يحتوي على عنصر ذاتي عند تعيين عتبات الصورة12,13. بطريقة مماثلة ، يسمح برنامج COMSTAT للمشغل بالاختيار من بين الشروط والمعلمات الأساسية إلى المتقدمة لتجزئة الصورة بالإضافة إلى عشر وظائف تحليل كمي (على سبيل المثال ، توزيع السمك ، مساحة السطح ، الكتلة الحيوية ، معامل الخشونة بدون أبعاد). قد يؤدي تعدد خيارات المستخدم ، بالإضافة إلى اختلاف مستويات خبرة المشغلين ، إلى الإبلاغ المضلل عن سلوك الأغشية الحيوية.
وبالتالي ، فإن الهدف من هذا البروتوكول هو تقديم طريقة بسيطة نسبيا للمقارنة الكمية لهياكل الأغشية الحيوية في المختبر باستخدام COMSTAT. هنا ، يتم التقاط صور ثلاثية الأبعاد لمقاطع الأغشية الحيوية من عزل CF P. aeruginosa عبر CLSM باستخدام نموذج غطاء زجاجي حجري14 – وهي تقنية راسخة تستخدم لإجراء تجارب الأغشية الحيوية القابلة للتكرار في المختبر . باستخدام COMSTAT كمكون إضافي ل ImageJ ، تسمح هذه الطريقة للباحثين بتحديد التغيرات في بنية الأغشية الحيوية كميا في وجود مضادات الميكروبات في ظل ظروف مختلفة. وبشكل عام، تهدف هذه الطريقة إلى القضاء على الاختلافات الذاتية المرتبطة بالتشغيل اليدوي للقاعدة العامة للإحصاء (COMSTAT)، وبالتالي تسهيل توحيد البروتوكولات عبر المراكز.
Protocol
Representative Results
Discussion
لا توجد طريقة محددة للمقارنة الكمية للصور ثلاثية الأبعاد لهياكل الأغشية الحيوية في المختبر ، وغالبا ما يصعب توحيد الإجراءات الموصوفة في هذا السياق بسبب التباين بين المشغلين20. وهكذا، يوفر هذا البروتوكول إطارا بسيطا وقابلا للتكرار لتطبيقات الكومستات التي تسعى إلى قياس ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا مؤسسة التليف الكيسي لتوفير التمويل لهذا البحث.
Materials
| Anti-Psl mAb, Psl0096 | Medimmune | ||
| Blood Agar (TSA with 5 % Sheep Blood) Medium | Fisher Scientific | R01200 | |
| Eight-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| Invitrogen SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Thermo Fisher Scientific | S34854 | |
| LB BROTH (LENNOX), Liquid Autoclave Sterilized | BioShop Canada | LBL666 | |
| Tobramycin, 900 µg/mg | Alfa Aesar by Thermo Fisher Scientific | J66040 | It is recommended to perform a minimal inhibitory concentration (MIC) test for every batch made to ensure quality control of antimicrobial potency |
| Quorum Volocity 6.3 | Quorum Technologies | Image analysis software |
References
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8, 623-633 (2010).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
- Rybtke, M., Hultqvist, L. D., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pseudomonas aeruginosa biofilm infections: community structure, antimicrobial tolerance and immune response. Journal of Molecular Biology. 427, 3628-3645 (2015).
- Wendel, A. F., Ressina, S., Kolbe-Busch, S., Pfeffer, K., MacKenzie, C. R. Species diversity of environmental GIM-1-producing bacteria collected during a long-term outbreak. Applied and Environmental Microbiology. 82, 3605-3610 (2016).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Powell, L. C., et al. Targeted disruption of the extracellular polymeric network of Pseudomonas aeruginosa biofilms by alginate oligosaccharides. NPJ Biofilms and Microbiomes. 4, 1-10 (2018).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T., Jensen, P. &. #. 2. 1. 6. ;., Wang, H., Høiby, N. Antimicrobial resistance, respiratory tract infections and role of biofilms in lung infections in cystic fibrosis patients. Advanced Drug Delivery Reviews. 85, 7-23 (2015).
- Landry, R. M., An, D., Hupp, J. T., Singh, P. K., Parsek, M. R. Mucin-Pseudomonas aeruginosa interactions promote biofilm formation and antibiotic resistance. Molecular Microbiology. 59, 142-151 (2006).
- Beaudoin, T., et al. Staphylococcus aureus interaction with Pseudomonas aeruginosa biofilm enhances tobramycin resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 3, 1-9 (2017).
- Rojo-Molinero, E., et al. Sequential treatment of biofilms with aztreonam and tobramycin is a novel strategy for combating Pseudomonas aeruginosa chronic respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, 2912-2922 (2016).
- Hentzer, M., et al. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. Journal of Bacteriology. 183, 5395-5401 (2001).
- Tolker-Nielsen, T., Sternberg, C. Growing and analyzing biofilms in flow chambers. Current Protocols in Microbiology. 21, 1-17 (2011).
- Luo, T. L., et al. A Sensitive thresholding method for confocal laser scanning microscope image stacks of microbial biofilms. Scientific Reports. 8, 1-14 (2018).
- Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model. Journal of Visualized Experiments. (118), e54819 (2016).
- DiGiandomenico, A., et al. Identification of broadly protective human antibodies to Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide Psl by phenotypic screening. Journal of Experimental Medicine. 209, 1273-1287 (2012).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
- Vorregaard, M. Comstat2 – a modern 3D image analysis environment for biofilms, in Informatics and Mathematical Modelling. Technical University of Denmark. , (2008).
- Hashemi, M. A., Khaddour, G., François, B., Massart, T. J., Salager, S. A tomographic imagery segmentation methodology for three-phase geomaterials based on simultaneous region growing. Acta Geotechnica. 9, 831-846 (2014).
- Rogowska, J. Overview and fundamentals of medical image segmentation. Handbook of Medical Image Processing and Analysis. , 73-90 (2009).
- Webb, D., et al. Assessing technician effects when extracting quantities from microscope images. Journal of Microbiological Methods. 53, 97-106 (2003).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43, 313-351 (2017).
- Xavier, J. B., et al. Objective threshold selection procedure (OTS) for segmentation of scanning laser confocal microscope images. Journal of Microbiological Methods. 47, 169-180 (2001).
- Arena, E. T., et al. Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 260 (2017).
- Daims, H., Wagner, M. Quantification of uncultured microorganisms by fluorescence microscopy and digital image analysis. Applied Microbiology and Biotechnology. 75, 237-248 (2007).
- Yerly, J., Hu, Y., Jones, S. M., Martinuzzi, R. J. A two-step procedure for automatic and accurate segmentation of volumetric CLSM biofilm images. Journal of Microbiological Methods. 70, 424-433 (2007).
- Lee, B., et al. Heterogeneity of biofilms formed by nonmucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5247-5255 (2005).
- Stapper, A. P., et al. Alginate production affects Pseudomonas aeruginosa biofilm development and architecture, but is not essential for biofilm formation. Journal of Medical Microbiology. 53, 679-690 (2004).
- Reichhardt, C., Parsek, M. Confocal laser scanning microscopy for analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture and matrix localization. Frontiers in Microbiology. 10, 677 (2019).
- Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Quantifying biofilm structure using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 39, 109-119 (2000).
- Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Evaluation of biofilm image thresholding methods. Water Research. 35, 1149-1158 (2001).
- Ross, S. S., et al. Quantification of confocal images of biofilms grown on irregular surfaces. Journal of Microbiological Methods. 100, 111-120 (2014).
- Ma, L., et al. Assembly and development of the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. PLoS Pathogens. 5, (2009).
- Mah, T. F., et al. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
- Srinandan, C. S., Jadav, V., Cecilia, D., Nerurkar, A. S. Nutrients determine the spatial architecture of Paracoccus sp. biofilm. Biofouling. 26, 449-459 (2010).
- Ramos, I., Dietrich, L. E., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Phenazines affect biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa in similar ways at various scales. Research in Microbiology. 161, 187-191 (2010).
- Ma, L., Jackson, K. D., Landry, R. M., Parsek, M. R., Wozniak, D. J. Analysis of Pseudomonas aeruginosa conditional psl variants reveals roles for the psl polysaccharide in adhesion and maintaining biofilm structure postattachment. Journal of Bacteriology. 188, 8213-8221 (2006).
