Quantification des effets des antimicrobiens sur l’architecture des biofilms in vitro à l’aide du logiciel COMSTAT
Summary
Les modifications induites par les antimicrobiens de l’architecture du biofilm de Pseudomonas aeruginosa diffèrent entre les isolats cliniques cultivés chez des patients atteints de mucoviscidose et d’infection pulmonaire chronique. Après la microscopie confocale, le logiciel COMSTAT peut être utilisé pour quantifier les variations de l’architecture du biofilm (p. ex., surface, épaisseur, biomasse) pour des isolats individuels afin d’évaluer l’efficacité des agents anti-infectieux.
Abstract
Les biofilms sont des agrégats de micro-organismes qui dépendent d’une matrice autoproduite de substance polymère extracellulaire pour la protection et l’intégrité structurelle. L’agent pathogène nosocomial, Pseudomonas aeruginosa, est connu pour adopter un mode de croissance de biofilm, provoquant une infection pulmonaire chronique chez les patients atteints de mucoviscidose (FK). Le programme informatique COMSTAT est un outil utile pour quantifier les changements induits par les antimicrobiens dans l’architecture du biofilm de P. aeruginosa en extrayant des données à partir d’images confocales tridimensionnelles. Cependant, le fonctionnement standardisé du logiciel est moins souvent abordé, ce qui est important pour un rapport optimal du comportement du biofilm et une comparaison intercentrique. Ainsi, l’objectif de ce protocole est de fournir un cadre simple et reproductible pour quantifier les structures de biofilms in vitro dans diverses conditions antimicrobiennes via COMSTAT. La technique est modélisée à l’aide d’un isolat de P. aeruginosa de la mucoviscidose, cultivé sous forme de réplicats de biofilm et exposé à la tobramycine et à l’anticorps monoclonal anti-Psl, Psl0096. L’approche étape par étape vise à réduire l’ambiguïté de l’utilisateur et à minimiser le risque de négliger des étapes cruciales de traitement d’image. Plus précisément, le protocole met l’accent sur l’élimination des variations subjectives associées au fonctionnement manuel de COMSTAT, y compris la segmentation d’images et la sélection de fonctions d’analyse quantitative appropriées. Bien que cette méthode oblige les utilisateurs à passer plus de temps à traiter des images confocales avant d’exécuter COMSTAT, elle permet de minimiser l’hétérogénicité erronée des biofilms dans les sorties automatisées.
Introduction
Les biofilms sont des agrégats de micro-organismes orientés dans une matrice de substances polymères extracellulaires (EPS) autoproduites. La matrice EPS est très complexe, composée principalement de cellules bactériennes, d’eau, de protéines, de polysaccharides, de lipides et d’acides nucléiques1, qui rendent tous les biofilms nettement différents des cellules planctoniques libres. Les biofilms EPS sont adhérents les uns aux autres et à diverses surfaces. La matrice EPS possède des propriétés qui interviennent dans l’échange de métabolites, de matériel génétique et de composés utilisés pour la signalisation et la défense intercellulaires2. Ces propriétés fournissent collectivement aux biofilms une intégrité structurelle et une protection contre les facteurs de stress externes, contribuant à l’évasion immunitaire et à la résistance aux antimicrobiens3.
Pseudomonas aeruginosa est un pathogène nosocomial bien connu, connu pour adopter une stratégie de croissance évasive du biofilm en réponse aux antimicrobiens. Un excellent exemple de cela se produit chez les patients atteints de la maladie génétique récessive, la mucoviscidose (FK). Les biofilms jouent un rôle central dans le développement de P. aeruginosa4 résistant aux antimicrobiens et permettent l’établissement d’une infection pulmonaire chronique chez les patients atteints de mucoviscidose, entraînant un déclin accéléré de la fonction pulmonaire et une mortalité prématurée5. Par conséquent, des études in vitro sur biofilm sont réalisées pour tester l’efficacité des antibiotiques et de nouveaux agents anti-infectieux contre les isolats de P. aeruginosa obtenus chez des patients atteints de FC 6,7. Après la formation du biofilm, les antimicrobiens sont appliqués à l’extérieur de la structure, et la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) est utilisée pour générer des reconstructions tridimensionnelles à haute résolution des segments de biofilm. Il est courant d’utiliser ensuite le logiciel informatique, COMSTAT, en tant que plug-in à ImageJ, pour quantifier les changements dans l’architecture du biofilm 8,9,10,11.
Bien que COMSTAT soit utile pour quantifier la structure du biofilm, la reproductibilité et la standardisation de l’analyse d’images sont moins souvent abordées. Par exemple, la procédure de traitement d’image, effectuée avant l’exécution de COMSTAT, est objective, mais contient un élément de subjectivité lors de la définition des seuils d’image12,13. De la même manière, le programme COMSTAT permet à l’opérateur de choisir des conditions et des paramètres de base à avancés pour la segmentation d’images ainsi que dix fonctions d’analyse quantitative (par exemple, la distribution de l’épaisseur, la surface, la biomasse, le coefficient de rugosité sans dimension). La multitude d’options d’utilisation, combinée aux différents niveaux d’expertise de l’opérateur, peut entraîner des rapports erronés sur le comportement du biofilm.
Ainsi, l’objectif de ce protocole est de présenter une méthode relativement simple pour la comparaison quantitative des structures de biofilms in vitro à l’aide de COMSTAT. Ici, des images tridimensionnelles de segments de biofilm d’un isolat de P. aeruginosa de la FC sont capturées par CLSM à l’aide du modèle14 à chambre de protection, une technique établie utilisée pour réaliser des expériences in vitro reproductibles sur biofilm. Utilisant COMSTAT comme plug-in d’ImageJ, cette méthode permet aux chercheurs d’identifier quantitativement les changements dans l’architecture du biofilm en présence d’antimicrobiens dans diverses conditions. Dans l’ensemble, cette méthode vise à éliminer les variations subjectives associées au fonctionnement manuel de COMSTAT, facilitant ainsi la standardisation des protocoles entre les centres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il n’existe pas de méthode prescrite pour comparer quantitativement les images tridimensionnelles des structures de biofilms in vitro , et les procédures décrites dans ce contexte sont souvent difficiles à normaliser en raison de la variabilité inter-opérateurs20. Ainsi, ce protocole offre un cadre simple et reproductible pour les applications COMSTAT cherchant à quantifier les changements dans l’architecture du biofilm in vitro dans diverses conditions antimicrobienne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier la Fondation de la fibrose kystique d’avoir financé cette recherche.
Materials
| Anti-Psl mAb, Psl0096 | Medimmune | ||
| Blood Agar (TSA with 5 % Sheep Blood) Medium | Fisher Scientific | R01200 | |
| Eight-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| Invitrogen SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Thermo Fisher Scientific | S34854 | |
| LB BROTH (LENNOX), Liquid Autoclave Sterilized | BioShop Canada | LBL666 | |
| Tobramycin, 900 µg/mg | Alfa Aesar by Thermo Fisher Scientific | J66040 | It is recommended to perform a minimal inhibitory concentration (MIC) test for every batch made to ensure quality control of antimicrobial potency |
| Quorum Volocity 6.3 | Quorum Technologies | Image analysis software |
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