JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Количественная оценка влияния противомикробных препаратов на архитектуру биопленки in vitro с помощью программного обеспечения COMSTAT

Published: December 14, 2020
doi:
10.3791/61759
, , , ,
1Translational Medicine,Hospital for Sick Children, 2Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine,Hospital for Sick Children, 3Infectious Diseases, Department of Pediatrics,Hospital for Sick Children

Summary

Антимикробные изменения архитектуры биопленки Pseudomonas aeruginosa различаются среди клинических изолятов, культивируемых у пациентов с муковисцидозом и хронической легочной инфекцией. После конфокальной микроскопии программное обеспечение COMSTAT может быть использовано для количественной оценки вариаций в архитектуре биопленки (например, площади поверхности, толщины, биомассы) для отдельных изолятов с целью оценки эффективности противоинфекционных агентов.

Abstract

Биопленки представляют собой агрегаты микроорганизмов, которые полагаются на самостоятельно производимую матрицу внеклеточного полимерного вещества для защиты и структурной целостности. Известно, что внутрибольничный патоген, Pseudomonas aeruginosa, принимает биопленочный режим роста, вызывая хроническую легочную инфекцию у пациентов с муковисцидозом (МВ). Компьютерная программа COMSTAT является полезным инструментом для количественной оценки антимикробных изменений в архитектуре биопленки P. aeruginosa путем извлечения данных из трехмерных конфокальных изображений. Тем не менее, стандартизированная работа программного обеспечения рассматривается реже, что важно для оптимальной отчетности о поведении биопленки и кросс-центрового сравнения. Таким образом, целью данного протокола является обеспечение простой и воспроизводимой основы для количественного определения биопленочных структур in vitro в различных антимикробных условиях с помощью COMSTAT. Метод смоделирован с использованием изолята CF P. aeruginosa , выращенного в виде репликатов биопленки и подвергнутого воздействию тобрамицина и моноклонального антитела против Psl Psl0096. Пошаговый подход направлен на уменьшение неопределенности для пользователя и минимизацию вероятности пропуска важных этапов обработки изображений. В частности, в протоколе подчеркивается устранение субъективных вариаций, связанных с ручной работой COMSTAT, включая сегментацию изображений и выбор соответствующих функций количественного анализа. Несмотря на то, что этот метод требует от пользователей дополнительных затрат времени на обработку конфокальных изображений перед запуском COMSTAT, он помогает свести к минимуму искаженную гетерогенность биопленки при автоматизированных выводах.

Introduction

Биопленки представляют собой агрегаты микроорганизмов, ориентированные в матрице самостоятельно производимых внеклеточных полимерных веществ (ЭПС). Матрица ЭПС очень сложна и состоит в основном из бактериальных клеток, воды, белков, полисахаридов, липидов и нуклеиновых кислот1, которые делают биопленки заметно отличающимися от свободно живущих планктонных клеток. Биопленочные ЭПС прилипают друг к другу и к различным поверхностям. Матрица EPS обладает свойствами, которые опосредуют межклеточный обмен метаболитов, генетического материала и соединений, используемых для межклеточной передачи сигналов и защиты2. Эти свойства в совокупности обеспечивают структурную целостность биопленки и защиту от внешних стрессоров, способствуя уклонению от иммунитета и устойчивости к противомикробным препаратам3.

Pseudomonas aeruginosa является хорошо известным внутрибольничным патогеном, который, как известно, использует стратегию уклончивого роста биопленки в ответ на противомикробные препараты. Ярким примером этого являются пациенты с рецессивным генетическим заболеванием, муковисцидозом (МВ). Биопленки играют ключевую роль в развитии устойчивой к противомикробным препаратам P. aeruginosa4 и позволяют установить хроническую легочную инфекцию у пациентов с муковисцидозом, вызывающую ускоренное снижение функции легких и преждевременную смертность5. В связи с этим проводятся исследования биопленки in vitro для проверки эффективности антибиотиков и новых противоинфекционных средств против изолятов P. aeruginosa, полученных от пациентов с CF 6,7. После формирования биопленки противомикробные препараты наносятся наружно на структуру, а конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) используется для создания трехмерных реконструкций сегментов биопленки с высоким разрешением. Обычной практикой является использование компьютерного программного обеспечения COMSTAT в качестве плагина к ImageJ для количественной оценки изменений в архитектуре биопленки 8,9,10,11.

Несмотря на то, что COMSTAT полезен для количественной оценки структуры биопленки, воспроизводимость и стандартизация анализа изображений рассматриваются реже. Например, процедура обработки изображений, выполняемая до запуска COMSTAT, является объективной, но содержит элемент субъективности при установке пороговых значений изображения12,13. Аналогичным образом, программа COMSTAT позволяет оператору выбирать от базовых до расширенных условий и параметров для сегментации изображения, а также десять функций количественного анализа (например, распределение толщины, площадь поверхности, биомасса, коэффициент безразмерной шероховатости). Множество пользовательских опций в сочетании с различным уровнем квалификации оператора может привести к ошибочному представлению информации о поведении биопленки.

Таким образом, целью данного протокола является представление относительно простого метода количественного сравнения биопленочных структур in vitro с использованием COMSTAT. В данной работе трехмерные изображения сегментов биопленки изолята CF P. aeruginosa захватываются с помощью CLSM с использованием модели покровного стекла в камере14 — признанной методики, используемой для проведения воспроизводимых экспериментов с биопленкой in vitro . Используя COMSTAT в качестве плагина к ImageJ, этот метод позволяет исследователям количественно идентифицировать изменения в архитектуре биопленки в присутствии противомикробных препаратов в различных условиях. В целом, этот метод направлен на устранение субъективных вариаций, связанных с ручным управлением COMSTAT, тем самым способствуя стандартизации протоколов в разных центрах.

Protocol

1. Сбор бактериальных изолятов Получите изоляты P. aeruginosa из когорты педиатрических пациентов с муковисцидозом, проходящих эрадикационное лечение ингаляционным тобрамицином в клинике SickKids (Торонто). Замораживайте изоляты при температуре -80 °C в цитрате глицерина и субкультуре…

Representative Results

Изолят P. aeruginosa, культивируемый у инфицированного пациента с муковисцидозом, используется для демонстрации преимуществ этого подхода в точном количественном определении антимикробных индуцированных изменений в архитектуре биопленки in vitro . Общий рабочий процесс этой модели…

Discussion

Не существует предписанного метода количественного сравнения трехмерных изображений биопленочных структур in vitro , и процедуры, описанные в этом контексте, часто трудно стандартизировать из-за межоператорной вариабельности. Таким образом, этот протокол предлагает пр…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы выражают признательность Фонду муковисцидоза за предоставление финансирования для этого исследования.

Materials

Anti-Psl mAb, Psl0096 Medimmune
Blood Agar (TSA with 5 % Sheep Blood) Medium Fisher Scientific R01200
Eight-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells Thermo Fisher Scientific 155411
Invitrogen SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain Thermo Fisher Scientific S34854
LB BROTH (LENNOX), Liquid Autoclave Sterilized BioShop Canada LBL666
Tobramycin, 900 µg/mg Alfa Aesar by Thermo Fisher Scientific J66040 It is recommended to perform a minimal inhibitory concentration (MIC) test for every batch made to ensure quality control of antimicrobial potency
Quorum Volocity 6.3 Quorum Technologies Image analysis software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8, 623-633 (2010).
  2. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
  3. Rybtke, M., Hultqvist, L. D., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pseudomonas aeruginosa biofilm infections: community structure, antimicrobial tolerance and immune response. Journal of Molecular Biology. 427, 3628-3645 (2015).
  4. Wendel, A. F., Ressina, S., Kolbe-Busch, S., Pfeffer, K., MacKenzie, C. R. Species diversity of environmental GIM-1-producing bacteria collected during a long-term outbreak. Applied and Environmental Microbiology. 82, 3605-3610 (2016).
  5. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  6. Powell, L. C., et al. Targeted disruption of the extracellular polymeric network of Pseudomonas aeruginosa biofilms by alginate oligosaccharides. NPJ Biofilms and Microbiomes. 4, 1-10 (2018).
  7. Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T., Jensen, P. &. #. 2. 1. 6. ;., Wang, H., Høiby, N. Antimicrobial resistance, respiratory tract infections and role of biofilms in lung infections in cystic fibrosis patients. Advanced Drug Delivery Reviews. 85, 7-23 (2015).
  8. Landry, R. M., An, D., Hupp, J. T., Singh, P. K., Parsek, M. R. Mucin-Pseudomonas aeruginosa interactions promote biofilm formation and antibiotic resistance. Molecular Microbiology. 59, 142-151 (2006).
  9. Beaudoin, T., et al. Staphylococcus aureus interaction with Pseudomonas aeruginosa biofilm enhances tobramycin resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 3, 1-9 (2017).
  10. Rojo-Molinero, E., et al. Sequential treatment of biofilms with aztreonam and tobramycin is a novel strategy for combating Pseudomonas aeruginosa chronic respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, 2912-2922 (2016).
  11. Hentzer, M., et al. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. Journal of Bacteriology. 183, 5395-5401 (2001).
  12. Tolker-Nielsen, T., Sternberg, C. Growing and analyzing biofilms in flow chambers. Current Protocols in Microbiology. 21, 1-17 (2011).
  13. Luo, T. L., et al. A Sensitive thresholding method for confocal laser scanning microscope image stacks of microbial biofilms. Scientific Reports. 8, 1-14 (2018).
  14. Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model. Journal of Visualized Experiments. (118), e54819 (2016).
  15. DiGiandomenico, A., et al. Identification of broadly protective human antibodies to Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide Psl by phenotypic screening. Journal of Experimental Medicine. 209, 1273-1287 (2012).
  16. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
  17. Vorregaard, M. Comstat2 – a modern 3D image analysis environment for biofilms, in Informatics and Mathematical Modelling. Technical University of Denmark. , (2008).
  18. Hashemi, M. A., Khaddour, G., François, B., Massart, T. J., Salager, S. A tomographic imagery segmentation methodology for three-phase geomaterials based on simultaneous region growing. Acta Geotechnica. 9, 831-846 (2014).
  19. Rogowska, J. Overview and fundamentals of medical image segmentation. Handbook of Medical Image Processing and Analysis. , 73-90 (2009).
  20. Webb, D., et al. Assessing technician effects when extracting quantities from microscope images. Journal of Microbiological Methods. 53, 97-106 (2003).
  21. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43, 313-351 (2017).
  22. Xavier, J. B., et al. Objective threshold selection procedure (OTS) for segmentation of scanning laser confocal microscope images. Journal of Microbiological Methods. 47, 169-180 (2001).
  23. Arena, E. T., et al. Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 260 (2017).
  24. Daims, H., Wagner, M. Quantification of uncultured microorganisms by fluorescence microscopy and digital image analysis. Applied Microbiology and Biotechnology. 75, 237-248 (2007).
  25. Yerly, J., Hu, Y., Jones, S. M., Martinuzzi, R. J. A two-step procedure for automatic and accurate segmentation of volumetric CLSM biofilm images. Journal of Microbiological Methods. 70, 424-433 (2007).
  26. Lee, B., et al. Heterogeneity of biofilms formed by nonmucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5247-5255 (2005).
  27. Stapper, A. P., et al. Alginate production affects Pseudomonas aeruginosa biofilm development and architecture, but is not essential for biofilm formation. Journal of Medical Microbiology. 53, 679-690 (2004).
  28. Reichhardt, C., Parsek, M. Confocal laser scanning microscopy for analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture and matrix localization. Frontiers in Microbiology. 10, 677 (2019).
  29. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Quantifying biofilm structure using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 39, 109-119 (2000).
  30. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Evaluation of biofilm image thresholding methods. Water Research. 35, 1149-1158 (2001).
  31. Ross, S. S., et al. Quantification of confocal images of biofilms grown on irregular surfaces. Journal of Microbiological Methods. 100, 111-120 (2014).
  32. Ma, L., et al. Assembly and development of the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. PLoS Pathogens. 5, (2009).
  33. Mah, T. F., et al. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
  34. Srinandan, C. S., Jadav, V., Cecilia, D., Nerurkar, A. S. Nutrients determine the spatial architecture of Paracoccus sp. biofilm. Biofouling. 26, 449-459 (2010).
  35. Ramos, I., Dietrich, L. E., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Phenazines affect biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa in similar ways at various scales. Research in Microbiology. 161, 187-191 (2010).
  36. Ma, L., Jackson, K. D., Landry, R. M., Parsek, M. R., Wozniak, D. J. Analysis of Pseudomonas aeruginosa conditional psl variants reveals roles for the psl polysaccharide in adhesion and maintaining biofilm structure postattachment. Journal of Bacteriology. 188, 8213-8221 (2006).

Tags

BiofilmAntimicrobialPseudomonas AeruginosaCOMSTATCystic FibrosisTobramycinAnti-Psl Monoclonal AntibodyImage SegmentationBiofilm ArchitectureConfocal Microscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Morris, A. J., Li, A., Jackson, L., Yau, Y. C. W., Waters, V. Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software. J. Vis. Exp. (166), e61759, doi:10.3791/61759 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image