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Immunology and Infection

COMSTAT 소프트웨어를 사용하여 체외 생물막 아키텍처에 대한 항균제의 효과 정량화

Published: December 14, 2020
doi:
10.3791/61759
, , , ,
1Translational Medicine,Hospital for Sick Children, 2Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine,Hospital for Sick Children, 3Infectious Diseases, Department of Pediatrics,Hospital for Sick Children

Summary

녹농균 생물막 구조에 대한 항균 유도 변화는 낭포성 섬유증 및 만성 폐 감염 환자로부터 배양한 임상 분리물 간에 다릅니다. 컨포칼 현미경 검사 후 COMSTAT 소프트웨어를 사용하여 항감염제의 효능을 평가하기 위해 개별 분리체에 대한 생물막 구조(예: 표면적, 두께, 바이오매스)의 변화를 정량화할 수 있습니다.

Abstract

생물막은 보호 및 구조적 무결성을 위해 자체 생산된 세포외 고분자 물질 매트릭스에 의존하는 미생물의 집합체입니다. 병원내 병원체인 녹농균( Pseudomonas aeruginosa )은 낭포성 섬유증(CF) 환자에게 만성 폐 감염을 일으키는 생물막 성장 방식을 채택하는 것으로 알려져 있습니다. 컴퓨터 프로그램인 COMSTAT는 3차원 공초점 이미지에서 데이터를 추출하여 녹농균 생물막 구조에서 항균 유도 변화를 정량화하는 데 유용한 도구입니다. 그러나 소프트웨어의 표준화된 작동은 일반적으로 다루어지지 않으며, 이는 생물막 거동에 대한 최적의 보고 및 센터 간 비교에 중요합니다. 따라서 이 프로토콜의 목표는 COMSTAT를 통해 다양한 항균 조건에서 체외 생물막 구조를 정량화하기 위한 간단하고 재현 가능한 프레임워크를 제공하는 것입니다. 이 기술은 생물막 복제 형태로 성장한 CF P. aeruginosa 분리물을 사용하여 모델링하고 tobramycin 및 항-Psl 단클론 항체인 Psl0096에 노출시킵니다. 단계별 접근 방식은 사용자의 모호성을 줄이고 중요한 이미지 처리 단계를 간과할 가능성을 최소화하는 것을 목표로 합니다. 특히, 이 프로토콜은 이미지 분할 및 적절한 정량 분석 기능 선택을 포함하여 COMSTAT의 수동 작동과 관련된 주관적 변동의 제거를 강조합니다. 이 방법을 사용하려면 사용자가 COMSTAT를 실행하기 전에 컨포칼 이미지를 처리하는 데 추가 시간을 소비해야 하지만, 자동화된 출력에서 잘못 표현된 생물막 이질성을 최소화하는 데 도움이 됩니다.

Introduction

생물막은 자체 생산된 세포외 고분자 물질(EPS)의 매트릭스를 배향하는 미생물의 집합체입니다. EPS 매트릭스는 주로 박테리아 세포, 물, 단백질, 다당류, 지질 및 핵산1으로 구성된 매우 복잡하며, 이 모든 것은 생물막을 자유 생활 플랑크톤 세포와 뚜렷하게 다르게 만듭니다. 생물막 EPS는 서로 접착되고 다양한 표면에 부착됩니다. EPS 매트릭스는 세포 간 신호 전달 및 방어에 사용되는 대사 산물, 유전 물질 및 화합물의 세포 간 교환을 매개하는 특성을 가지고 있습니다2. 이러한 특성은 집합적으로 생물막의 구조적 무결성과 외부 스트레스 요인에 대한 보호를 제공하여 면역 회피 및 항생제 내성에 기여합니다3.

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 잘 알려진 병원내 병원체로, 항균제에 대한 반응으로 회피성 생물막 성장 전략을 채택하는 것으로 알려져 있습니다. 이에 대한 대표적인 예가 열성 유전 질환인 낭포성 섬유증(CF)이 있는 환자에서 발생합니다. 생물막은 항생제 내성 녹농균(P. aeruginosa)4의 발병에 중추적인 역할을 하며, CF 환자에서 만성 폐 감염을 일으켜 폐 기능 저하를 가속화하고 조기 사망을 초래한다5. 따라서 CF 6,7 환자로부터 얻은 녹농균 분리제에 대한 항생제 및 새로운 항감염제의 효능을 테스트하기 위해 시험관 내 생물막 연구를 수행합니다. 생물막 형성 후 항균제를 구조물 외부에 적용하고 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용하여 생물막 세그먼트의 고해상도 3차원 재구성을 생성합니다. 그런 다음 컴퓨터 소프트웨어인 COMSTAT를 ImageJ의 플러그인으로 사용하여 생물막 아키텍처 8,9,10,11의 변화를 정량화하는 것이 일반적입니다.

COMSTAT는 생물막 구조를 정량화하는 데 유용하지만 이미지 분석의 재현성 및 표준화는 일반적으로 다루어지지 않습니다. 예를 들어, COMSTAT를 실행하기 전에 수행된 이미지 처리 절차는 객관적이지만 이미지 임계값(12,13)을 설정할 때 주관성 요소를 포함합니다. 유사한 방식으로 COMSTAT 프로그램을 사용하면 작업자가 이미지 분할을 위한 기본 및 고급 조건 및 매개변수를 선택할 수 있을 뿐만 아니라 10가지 정량 분석 기능(예: 두께 분포, 표면적, 바이오매스, 무차원 거칠기 계수)을 선택할 수 있습니다. 다양한 사용자 옵션과 다양한 작업자 전문 지식 수준이 결합되어 생물막 거동에 대한 잘못된 보고가 발생할 수 있습니다.

따라서 이 프로토콜의 목표는 COMSTAT를 사용하여 체외 생물막 구조의 정량적 비교를 위한 비교적 간단한 방법을 제시하는 것입니다. 여기에서, CF P. aeruginosa 분리체의 생물막 세그먼트의 3차원 이미지는 재현 가능한 시험관 내 생물막 실험을 수행하는 데 사용되는 확립된 기술인 챔버형 커버글라스 모델14를 사용하여 CLSM을 통해 캡처됩니다. COMSTAT를 ImageJ의 플러그인으로 활용하는 이 방법을 통해 연구원은 다양한 조건에서 항균제가 있는 경우 생물막 구조의 변화를 정량적으로 식별할 수 있습니다. 전반적으로 이 방법은 COMSTAT의 수동 작동과 관련된 주관적인 변동을 제거하여 센터 간 프로토콜의 표준화를 용이하게 하는 것을 목표로 합니다.

Protocol

1. 세균 분리 수집 SickKids(토론토)에서 흡입 토브라마이신으로 박멸 치료를 받고 있는 CF가 있는 소아 환자 코호트에서 분리한 P. 녹농균을 얻습니다. -80 °C에서 글리세롤 시트레이트 및 하위 배양물에서 사용 전에 최소 3회 동결합니다. 2. 생체외 생물막 형성 참고: 변형을 가한 체외 생물막 형성을 위해 챔버형 커버글라스 방?…

Representative Results

CF에 감염된 환자로부터 배양한 녹농균 분리물은 체외 생물막 구조에서 항균제에 의한 변화를 정확하게 정량화하는 데 있어 이 접근법의 강점을 입증하는 데 사용됩니다. 이 모델의 전체 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다. ImageJ의 이미지 처리 및 COMSTAT 분석 절차는 그림 2에 나와 있습니다. CLSM z-stack 이미지(OME-TIFF로 저장됨)에 적용된 Imag…

Discussion

in vitro biofilm 구조의 3차원 이미지를 정량적으로 비교하기 위한 규정된 방법은 없으며, 이러한 맥락에서 설명된 절차는 작업자 간 변동성(inter-operator variability)으로 인해 표준화하기 어려운 경우가 많다(20). 따라서 이 프로토콜은 다양한 항균 조건에서 체외 생물막 구조의 변화를 정량화하려는 COMSTAT 응용 분야에 간단하고 재현 가능한 프레임워크를 제공합니다. 이 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자들은 이 연구에 자금을 제공한 낭포성 섬유증 재단(Cystic Fibrosis Foundation)에 감사를 표하고자 합니다.

Materials

Anti-Psl mAb, Psl0096 Medimmune
Blood Agar (TSA with 5 % Sheep Blood) Medium Fisher Scientific R01200
Eight-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells Thermo Fisher Scientific 155411
Invitrogen SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain Thermo Fisher Scientific S34854
LB BROTH (LENNOX), Liquid Autoclave Sterilized BioShop Canada LBL666
Tobramycin, 900 µg/mg Alfa Aesar by Thermo Fisher Scientific J66040 It is recommended to perform a minimal inhibitory concentration (MIC) test for every batch made to ensure quality control of antimicrobial potency
Quorum Volocity 6.3 Quorum Technologies Image analysis software
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References

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Morris, A. J., Li, A., Jackson, L., Yau, Y. C. W., Waters, V. Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software. J. Vis. Exp. (166), e61759, doi:10.3791/61759 (2020).
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