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Immunology and Infection

COMSTATソフトウェアを使用した In vitro バイオフィルムアーキテクチャに対する抗菌剤の影響の定量化

Published: December 14, 2020
doi:
10.3791/61759
, , , ,
1Translational Medicine,Hospital for Sick Children, 2Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine,Hospital for Sick Children, 3Infectious Diseases, Department of Pediatrics,Hospital for Sick Children

Summary

緑膿菌のバイオフィルム構造に対する抗菌薬による変化は、嚢胞性線維症および慢性肺感染症の患者から培養された臨床分離株によって異なります。共焦点顕微鏡法に続いて、COMSTATソフトウェアを使用して、個々の分離株のバイオフィルム構造(表面積、厚さ、バイオマスなど)の変動を定量化し、抗感染剤の有効性を評価できます。

Abstract

バイオフィルムは、細胞外高分子物質の自己生成マトリックスに依存して保護と構造的完全性を確保する微生物の集合体です。院内病原体である 緑膿菌は、 バイオフィルムの成長様式を採用し、嚢胞性線維症(CF)患者に慢性肺感染症を引き起こすことが知られています。コンピュータプログラムであるCOMSTATは、3次元共焦点画像からデータを抽出することにより、 緑膿菌の バイオフィルム構造における抗菌薬による変化を定量化するための有用なツールです。しかし、ソフトウェアの標準化された操作はあまり一般的ではなく、バイオフィルムの挙動を最適に報告し、中心を越えた比較を行うためには重要です。したがって、このプロトコルの目的は、COMSTATを介してさまざまな抗菌条件下で in vitro バイオフィルム構造を定量化するためのシンプルで再現性のあるフレームワークを提供することです。この手法は、CF P. aeruginosa 分離株を使用してモデル化され、バイオフィルム複製の形で成長させ、トブラマイシンと抗 Psl モノクローナル抗体 Psl0096 に曝露されます。この段階的なアプローチは、ユーザーの曖昧さを減らし、重要な画像処理ステップを見落とす可能性を最小限に抑えることを目的としています。具体的には、このプロトコルは、画像のセグメンテーションや適切な定量分析機能の選択など、COMSTATの手動操作に関連する主観的な変動の排除を強調しています。この方法では、COMSTATを実行する前に共焦点画像の処理に余分な時間を費やす必要がありますが、自動出力で誤って表現されたバイオフィルムの不均一性を最小限に抑えるのに役立ちます。

Introduction

バイオフィルムは、自己生成した細胞外高分子物質(EPS)のマトリックスに配向した微生物の凝集体です。EPSマトリックスは非常に複雑で、主に細菌細胞、水、タンパク質、多糖類、脂質、核酸1で構成されており、これらすべてがバイオフィルムを自由生活のプランクトン細胞とは明らかに異なるものにしています。バイオフィルムEPSは、互いに接着し、さまざまな表面に付着します。EPSマトリックスは、代謝物、遺伝物質、および細胞間シグナル伝達と防御に使用される化合物の細胞間交換を媒介する特性を持っています2。これらの特性は、バイオフィルムの構造的完全性と外部ストレス要因からの保護を総合的に提供し、免疫回避と抗菌耐性に貢献します3。

緑膿菌は、よく知られている院内病原体であり、抗菌薬に応答して回避的なバイオフィルム成長戦略を採用することが知られています。この代表的な例は、劣性遺伝性疾患である嚢胞性線維症(CF)の患者に発生します。バイオフィルムは、抗菌薬耐性緑膿菌4の発症に極めて重要な役割を果たし、CF患者の慢性肺感染症の確立を可能にし、肺機能の低下と早期死亡の加速を引き起こします5。したがって、in vitro バイオフィルム研究は、CF 6,7 患者から得られた緑膿菌分離株に対する抗生物質および新しい抗感染剤の有効性をテストするために実施されます。バイオフィルム形成後、抗菌剤を構造の外部に塗布し、共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を使用して、バイオフィルムセグメントの高解像度の3次元再構成を生成します。その後、コンピュータソフトウェアであるCOMSTATをImageJのプラグインとして使用して、バイオフィルムアーキテクチャ8,9,10,11の変化を定量化するのが一般的な方法です。

COMSTATはバイオフィルム構造の定量化には有用ですが、画像解析の再現性と標準化についてはあまり注目されていません。例えば、COMSTAT を実行する前に実行されるイメージ処理プロシージャーは客観的ですが、イメージしきい値12,13 を設定する際には主観的な要素を含んでいます。同様に、COMSTATプログラムでは、オペレーターは画像セグメンテーションの基本条件から高度な条件、パラメータ、および10の定量分析機能(厚さ分布、表面積、バイオマス、無次元粗さ係数など)を選択できます。多数のユーザーオプションとさまざまなオペレーターの専門知識レベルが組み合わさると、バイオフィルムの動作に関する誤った報告につながる可能性があります。

したがって、このプロトコルの目標は、COMSTATを使用してin vitroバイオフィルム構造を定量的に比較するための比較的簡単な方法を提示することです。ここでは、CF P. aeruginosa分離株からのバイオフィルムセグメントの3次元画像を、再現性のあるin vitroバイオフィルム実験を行うために使用される確立された技術であるチャンバーカバーガラスモデル14を使用してCLSMを介してキャプチャします。この手法は、COMSTATをImageJのプラグインとして利用することで、研究者はさまざまな条件下で抗菌剤の存在下でのバイオフィルム構造の変化を定量的に特定することができます。全体として、この方法は、COMSTATの手動操作に関連する主観的なばらつきを排除することを目的としており、それによってセンター間でのプロトコルの標準化を促進します。

Protocol

1.細菌分離物の収集 SickKids(トロント)で吸入トブラマイシンによる根絶治療を受けているCFの小児患者のコホートから 緑膿菌 分離株を入手します。分離株をクエン酸グリセロールで-80°Cで凍結し、使用前に少なくとも3回サブカルチャーします。 2. in vitro バイオフィルム形成 注:改変を加えたin vitroバイオフィルム形成に?…

Representative Results

CFに感染した患者から培養した 緑膿菌分離 株を用いて、 in vitro バイオフィルム構造における抗菌薬による変化を正確に定量化するこのアプローチの強みを実証します。このモデルの全体的なワークフローを 図 1 に示します。ImageJ での画像処理と COMSTAT 分析の手順を図 2 に示します。図 3 に、CLSM z スタック画?…

Discussion

in vitroバイオフィルム構造の3次元画像を定量的に比較するための規定された方法はなく、この文脈で説明される手順は、オペレーター間のばらつきのために標準化するのが難しいことがよくあります20。したがって、このプロトコルは、さまざまな抗菌条件下でのin vitroバイオフィルム構造の変化を定量化しようとするCOMSTATアプリケーションのためのシンプル?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、この研究に資金を提供してくれた嚢胞性線維症財団に感謝したいと思います。

Materials

Anti-Psl mAb, Psl0096 Medimmune
Blood Agar (TSA with 5 % Sheep Blood) Medium Fisher Scientific R01200
Eight-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells Thermo Fisher Scientific 155411
Invitrogen SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain Thermo Fisher Scientific S34854
LB BROTH (LENNOX), Liquid Autoclave Sterilized BioShop Canada LBL666
Tobramycin, 900 µg/mg Alfa Aesar by Thermo Fisher Scientific J66040 It is recommended to perform a minimal inhibitory concentration (MIC) test for every batch made to ensure quality control of antimicrobial potency
Quorum Volocity 6.3 Quorum Technologies Image analysis software
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References

  1. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8, 623-633 (2010).
  2. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
  3. Rybtke, M., Hultqvist, L. D., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pseudomonas aeruginosa biofilm infections: community structure, antimicrobial tolerance and immune response. Journal of Molecular Biology. 427, 3628-3645 (2015).
  4. Wendel, A. F., Ressina, S., Kolbe-Busch, S., Pfeffer, K., MacKenzie, C. R. Species diversity of environmental GIM-1-producing bacteria collected during a long-term outbreak. Applied and Environmental Microbiology. 82, 3605-3610 (2016).
  5. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  6. Powell, L. C., et al. Targeted disruption of the extracellular polymeric network of Pseudomonas aeruginosa biofilms by alginate oligosaccharides. NPJ Biofilms and Microbiomes. 4, 1-10 (2018).
  7. Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T., Jensen, P. &. #. 2. 1. 6. ;., Wang, H., Høiby, N. Antimicrobial resistance, respiratory tract infections and role of biofilms in lung infections in cystic fibrosis patients. Advanced Drug Delivery Reviews. 85, 7-23 (2015).
  8. Landry, R. M., An, D., Hupp, J. T., Singh, P. K., Parsek, M. R. Mucin-Pseudomonas aeruginosa interactions promote biofilm formation and antibiotic resistance. Molecular Microbiology. 59, 142-151 (2006).
  9. Beaudoin, T., et al. Staphylococcus aureus interaction with Pseudomonas aeruginosa biofilm enhances tobramycin resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 3, 1-9 (2017).
  10. Rojo-Molinero, E., et al. Sequential treatment of biofilms with aztreonam and tobramycin is a novel strategy for combating Pseudomonas aeruginosa chronic respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, 2912-2922 (2016).
  11. Hentzer, M., et al. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. Journal of Bacteriology. 183, 5395-5401 (2001).
  12. Tolker-Nielsen, T., Sternberg, C. Growing and analyzing biofilms in flow chambers. Current Protocols in Microbiology. 21, 1-17 (2011).
  13. Luo, T. L., et al. A Sensitive thresholding method for confocal laser scanning microscope image stacks of microbial biofilms. Scientific Reports. 8, 1-14 (2018).
  14. Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model. Journal of Visualized Experiments. (118), e54819 (2016).
  15. DiGiandomenico, A., et al. Identification of broadly protective human antibodies to Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide Psl by phenotypic screening. Journal of Experimental Medicine. 209, 1273-1287 (2012).
  16. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
  17. Vorregaard, M. Comstat2 – a modern 3D image analysis environment for biofilms, in Informatics and Mathematical Modelling. Technical University of Denmark. , (2008).
  18. Hashemi, M. A., Khaddour, G., François, B., Massart, T. J., Salager, S. A tomographic imagery segmentation methodology for three-phase geomaterials based on simultaneous region growing. Acta Geotechnica. 9, 831-846 (2014).
  19. Rogowska, J. Overview and fundamentals of medical image segmentation. Handbook of Medical Image Processing and Analysis. , 73-90 (2009).
  20. Webb, D., et al. Assessing technician effects when extracting quantities from microscope images. Journal of Microbiological Methods. 53, 97-106 (2003).
  21. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43, 313-351 (2017).
  22. Xavier, J. B., et al. Objective threshold selection procedure (OTS) for segmentation of scanning laser confocal microscope images. Journal of Microbiological Methods. 47, 169-180 (2001).
  23. Arena, E. T., et al. Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 260 (2017).
  24. Daims, H., Wagner, M. Quantification of uncultured microorganisms by fluorescence microscopy and digital image analysis. Applied Microbiology and Biotechnology. 75, 237-248 (2007).
  25. Yerly, J., Hu, Y., Jones, S. M., Martinuzzi, R. J. A two-step procedure for automatic and accurate segmentation of volumetric CLSM biofilm images. Journal of Microbiological Methods. 70, 424-433 (2007).
  26. Lee, B., et al. Heterogeneity of biofilms formed by nonmucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5247-5255 (2005).
  27. Stapper, A. P., et al. Alginate production affects Pseudomonas aeruginosa biofilm development and architecture, but is not essential for biofilm formation. Journal of Medical Microbiology. 53, 679-690 (2004).
  28. Reichhardt, C., Parsek, M. Confocal laser scanning microscopy for analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture and matrix localization. Frontiers in Microbiology. 10, 677 (2019).
  29. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Quantifying biofilm structure using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 39, 109-119 (2000).
  30. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Evaluation of biofilm image thresholding methods. Water Research. 35, 1149-1158 (2001).
  31. Ross, S. S., et al. Quantification of confocal images of biofilms grown on irregular surfaces. Journal of Microbiological Methods. 100, 111-120 (2014).
  32. Ma, L., et al. Assembly and development of the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. PLoS Pathogens. 5, (2009).
  33. Mah, T. F., et al. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
  34. Srinandan, C. S., Jadav, V., Cecilia, D., Nerurkar, A. S. Nutrients determine the spatial architecture of Paracoccus sp. biofilm. Biofouling. 26, 449-459 (2010).
  35. Ramos, I., Dietrich, L. E., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Phenazines affect biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa in similar ways at various scales. Research in Microbiology. 161, 187-191 (2010).
  36. Ma, L., Jackson, K. D., Landry, R. M., Parsek, M. R., Wozniak, D. J. Analysis of Pseudomonas aeruginosa conditional psl variants reveals roles for the psl polysaccharide in adhesion and maintaining biofilm structure postattachment. Journal of Bacteriology. 188, 8213-8221 (2006).

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Morris, A. J., Li, A., Jackson, L., Yau, Y. C. W., Waters, V. Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software. J. Vis. Exp. (166), e61759, doi:10.3791/61759 (2020).
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