Quantificazione degli effetti degli antimicrobici sull'architettura del biofilm in vitro utilizzando il software COMSTAT

Summary

Le alterazioni indotte da antimicrobici dell’architettura del biofilm di Pseudomonas aeruginosa differiscono tra gli isolati clinici coltivati da pazienti con fibrosi cistica e infezione polmonare cronica. Dopo la microscopia confocale, il software COMSTAT può essere utilizzato per quantificare le variazioni nell’architettura del biofilm (ad esempio, area superficiale, spessore, biomassa) per i singoli isolati per valutare l’efficacia degli agenti anti-infettivi.

Abstract

I biofilm sono aggregati di microrganismi che si basano su una matrice autoprodotta di sostanza polimerica extracellulare per la protezione e l’integrità strutturale. Il patogeno nosocomiale, Pseudomonas aeruginosa, è noto per adottare una modalità di crescita del biofilm, causando infezione polmonare cronica nei pazienti con fibrosi cistica (FC). Il programma informatico, COMSTAT, è uno strumento utile per quantificare i cambiamenti indotti da antimicrobici nell’architettura del biofilm di P. aeruginosa estraendo dati da immagini confocali tridimensionali. Tuttavia, il funzionamento standardizzato del software è meno comunemente affrontato, il che è importante per la segnalazione ottimale del comportamento del biofilm e il confronto tra i centri. Pertanto, l’obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un quadro semplice e riproducibile per quantificare le strutture del biofilm in vitro in condizioni antimicrobiche variabili tramite COMSTAT. La tecnica è modellata utilizzando un isolato di CF P. aeruginosa , coltivato sotto forma di repliche di biofilm ed esposto alla tobramicina e all’anticorpo monoclonale anti-Psl, Psl0096. L’approccio graduale mira a ridurre l’ambiguità dell’utente e a minimizzare la possibilità di trascurare le fasi cruciali dell’elaborazione delle immagini. In particolare, il protocollo enfatizza l’eliminazione delle variazioni soggettive associate al funzionamento manuale di COMSTAT, tra cui la segmentazione delle immagini e la selezione di appropriate funzioni di analisi quantitativa. Sebbene questo metodo richieda agli utenti di dedicare più tempo all’elaborazione di immagini confocali prima di eseguire COMSTAT, aiuta a ridurre al minimo l’eterogenicità del biofilm travisato negli output automatizzati.

Introduction

I biofilm sono aggregati di microrganismi orientati in una matrice di sostanze polimeriche extracellulari (EPS) autoprodotte. La matrice EPS è molto complessa, costituita principalmente da cellule batteriche, acqua, proteine, polisaccaridi, lipidi e acidi nucleici¹, che rendono i biofilm nettamente diversi dalle cellule planctoniche a vita libera. I Biofilm EPS sono aderenti l’uno all’altro e alle varie superfici. La matrice EPS ha proprietà che mediano lo scambio cellula-cellula di metaboliti, materiale genetico e composti utilizzati per la segnalazione e la difesa intercellulare². Queste proprietà forniscono collettivamente integrità strutturale dei biofilm e protezione contro i fattori di stress esterni, contribuendo all’evasione immunitaria e alla resistenza antimicrobica³.

Pseudomonas aeruginosa è un patogeno nosocomiale ben noto, noto per adottare una strategia evasiva di crescita del biofilm in risposta agli antimicrobici. Un primo esempio di ciò si verifica nei pazienti con la malattia genetica recessiva, la fibrosi cistica (FC). I biofilm svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo di P. aeruginosa 4 resistente agli ^{antimicrobici e} consentono l’instaurarsi di un’infezione polmonare cronica nei pazienti con FC, causando un declino accelerato della funzione polmonare e una mortalità prematura⁵. Pertanto, vengono eseguiti studi in vitro sul biofilm per testare l’efficacia di antibiotici e nuovi agenti antinfettivi contro gli isolati di P. aeruginosa ottenuti da pazienti con FC ^6,7. Dopo la formazione del biofilm, gli antimicrobici vengono applicati esternamente alla struttura e la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) viene utilizzata per generare ricostruzioni tridimensionali ad alta risoluzione di segmenti di biofilm. È pratica comune utilizzare il software per computer, COMSTAT, come plug-in di ImageJ, per quantificare i cambiamenti nell’architettura del biofilm 8,9,10,11.

Sebbene COMSTAT sia utile per quantificare la struttura del biofilm, la riproducibilità e la standardizzazione dell’analisi delle immagini sono meno comunemente affrontate. Ad esempio, la procedura di elaborazione delle immagini, eseguita prima dell’esecuzione di COMSTAT, è oggettiva, ma contiene un elemento di soggettività quando si impostano le soglie delle immagini^12,13. Allo stesso modo, il programma COMSTAT consente all’operatore di scegliere tra condizioni e parametri di base e avanzati per la segmentazione delle immagini, nonché dieci funzioni di analisi quantitativa (ad esempio, distribuzione dello spessore, area superficiale, biomassa, coefficiente di rugosità adimensionale). La moltitudine di opzioni per l’utente, combinate con i diversi livelli di esperienza dell’operatore, può portare a una segnalazione errata del comportamento del biofilm.

Pertanto, l’obiettivo di questo protocollo è quello di presentare un metodo relativamente semplice per il confronto quantitativo di strutture di biofilm in vitro utilizzando COMSTAT. In questo articolo, le immagini tridimensionali dei segmenti di biofilm di un isolato di CF P. aeruginosa vengono acquisite tramite CLSM utilizzando il modello¹⁴ di vetro di copertura a camera, una tecnica consolidata utilizzata per eseguire esperimenti di biofilm in vitro riproducibili. Utilizzando COMSTAT come plug-in di ImageJ, questo metodo consente ai ricercatori di identificare quantitativamente i cambiamenti nell’architettura del biofilm in presenza di antimicrobici in condizioni variabili. Nel complesso, questo metodo mira a eliminare le variazioni soggettive associate al funzionamento manuale di COMSTAT, facilitando così la standardizzazione dei protocolli tra i centri.

Protocol

1. Raccolta di isolati batterici Ottenere isolati di P. aeruginosa da una coorte di pazienti pediatrici con FC sottoposti a trattamento di eradicazione con tobramicina per via inalatoria presso SickKids (Toronto). Congelare gli isolati a -80 °C in glicerolo citrato e sottocoltura almeno tre volte prima dell’uso. 2. Formazione di biofilm in vitro NOTA: Utilizzare un metodo di coverglass a camera1 per la formazi…

Representative Results

Un isolato di P. aeruginosa coltivato da un paziente infetto con FC viene utilizzato per dimostrare i punti di forza di questo approccio nel quantificare accuratamente i cambiamenti indotti da antimicrobici nell’architettura del biofilm in vitro . Il flusso di lavoro complessivo di questo modello è rappresentato nella Figura 1. La procedura di elaborazione delle immagini e di analisi COMSTAT in ImageJ è illustrata nella Figura 2. Nella <stron…

Discussion

Non esiste un metodo prescritto per confrontare quantitativamente immagini tridimensionali di strutture di biofilm in vitro e le procedure descritte in questo contesto sono spesso difficili da standardizzare a causa della variabilità interoperatore²⁰. Pertanto, questo protocollo offre un quadro semplice e riproducibile per le applicazioni COMSTAT che cercano di quantificare i cambiamenti nell’architettura del biofilm in vitro in condizioni antimicrobiche variabili. I punti di fo…

Materials

Anti-Psl mAb, Psl0096	Medimmune
Blood Agar (TSA with 5 % Sheep Blood) Medium	Fisher Scientific	R01200
Eight-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells	Thermo Fisher Scientific	155411
Invitrogen SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain	Thermo Fisher Scientific	S34854
LB BROTH (LENNOX), Liquid Autoclave Sterilized	BioShop Canada	LBL666
Tobramycin, 900 µg/mg	Alfa Aesar by Thermo Fisher Scientific	J66040	It is recommended to perform a minimal inhibitory concentration (MIC) test for every batch made to ensure quality control of antimicrobial potency
Quorum Volocity 6.3	Quorum Technologies		Image analysis software