İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinde DNA Hasarı ve Onarım Foci İmmünofloresan Görüntüleme
Summary
Bor nötron yakalama terapisinde (BNCT) kullanılan nötron karışık ışınıile aktive edilen radyasyona bağlı DNA hasar tepkisi tam olarak belirlenmemiştir. Bu protokol, nötron-karışık ışın ile ışınlama sonra insan kolon kanseri hücre hatlarında immünofloresan boyama tarafından onarım proteinlerinin radyasyonkaynaklı foci (RIF) tespit etmek için adım adım bir prosedür sağlar.
Abstract
Makalenin amacı, bor nötron yakalama terapisinde (BNCT) kullanılan nötron-gama karışık ışınının neden olduğu radyasyona bağlı DNA hasar yanıtını incelemek için immünoresans mikroskobu için adım adım bir protokol sağlamaktır. Özellikle, önerilen metodoloji DNA çift iplikçik sonları (DNA-DSBs) özgü antikorlar kullanılarak fok olarak görüntülenebilir onarım proteinleri aktivasyonu tespiti için uygulanır. DNA onarım odakları, nötron-karışık ışınla ışınlama sonrası kolon kanseri hücrelerinde (HCT-116) immünororesans ile değerlendirildi. DNA-DSB’ler en genotoksik lezyonlardır ve memeli hücrelerinde iki ana yol ile onarılır: homolog olmayan son birleştirme yolu (NHEJ) ve homolog rekombinasyon onarımı (HRR). Γ-H2AX, 53BP1 gibi radyobiyolojide yaygın olarak kullanılan belirteçler için fokların frekansları, 53BP1 DNA-DSB numarası ile ilişkilidir ve DNA-DSB’lerin indüksiyon ve onarımını izlemek için etkili ve hassas belirteçler olarak kabul edilir. Γ-H2AX foci’nin onarım proteinlerini cezbettiği ve DSB’ye yakın onarım faktörlerinin daha yüksek bir konsantrasyona yol ettiği tespit edilmiştir. HÜCRESEL düzeyde DNA hasarını izlemek için, NHEJ yolundan DNA-PKcs temsilcisi onarım protein foci ve HRR yolundan Rad52 varlığı için immünofloresans analizi planlandı. NHEJ ve HRR yollarından gelen onarım faktörlerine özgü antikorlar ve radyasyona bağlı foci (RIF) ile radyasyona bağlı DNA hasar yanıtının tespiti için güvenilir bir immünorfloresans boyama protokolü geliştirdik ve uygulamaya koyduk. Önerilen metodoloji, nötron-karışık ışın radyasyonu durumunda yüksek oranda aktive olan ve onarım yolunun hakimiyetini gösteren onarım proteinini araştırmak için kullanılabilir.
Introduction
Bor nötron yakalama terapisinde (BNCT) kullanılan nötron karışık ışınıile aktive edilen radyasyona bağlı DNA hasar tepkisi tam olarak belirlenmemiştir. Bu protokol, nötron la karışık ışınla ışınlama dan sonra insan kolon kanseri hücre hattında immünororesans boyama gibi, radyasyonkaynaklı fok (RIF) onarım proteinlerinin tespitini gerçekleştirmek için adım adım bir prosedür sağlar.
İzole radyasyon (IR) DNA çift iplikçik sonları en genotoksik DNA lezyonları olan DNA hasarı (DNA-DSBs, DNA-SSBs, DNA baz hasarı) farklı türde çok sayıda neden olur1. Onarılmamış molalar hücre ölümüne neden olabilir, yanlış tamir edilmiş molalar kromozom yeniden düzenlenmesi, mutagenezi ve belirleyici genetik bilgi kaybı olasılığını yükseltir. DSB’lere yanıt veren hasar yanıt yolları arasında homolog olmayan son birleştirme (NHEJ), Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4 ve DNA ligaz IV gerektiren bir mekanizma gibi DNA onarım yolları yer almaktadır2,3,4,5,6. Memelilerde ikinci ana DNA onarım yolu, rad52 epistazis gen ailesi- Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 ve Rad587olmak üzere temel bileşenler gerektiren homolog rekombinasyon onarımı (HRR) yoludur. Rad51 ve Rad54 ökaryotlarda replikasyon stresi ve DNA kırılmaları ile ilgili onarım mekanizmalarında önemli insan rekombinasyon faktörleridir. İlginçtir, HRR yolunun downregulation genom stabilitesi için Hr yolu alaka işaret hata eğilimli NHEJ yolu geliştirir gözlenmiştir8.
DSBoluşumunun ilk adımı Pi3 kilaz ailesinden Ataxia telangieektazi mutasyona uğramış kilaz (ATM) tarafından Ser-139 γ-H2AX histonun fosforilasyon olduğunu7,8. İlginçtir, H2AX fosforilasyon fosforlu H2AX6için özel antikorlar kullanarak foci (γ-H2AX foci) olarak immünorfloresan tekniği ile kolayca görüntülenebilir. DSB’lerin sayısı ile γ-H2AX odakları arasında 1:1 ilişki vardır, bu nedenle, DSB marker, γ-H2AX, foci oluşumu, büyüklüğü ve miktarı6,7,,8,9,10,11karakterizasyonu ile kapsamlı olarak incelenir. Γ-H2AX foci oluşumu işe ve DNA hasar yanıtı (DDR) proteinleri ve kromatin değiştirici faktörlerin birikimine yol açar, gibi 53BP1 (p53 bağlayıcı protein 1), MDC1 (DNA hasar kontrol noktası arabulucusu), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, ve diğer birçok onarım faktörleri böylece radyasyon kaynaklı foci (RIF) oluşturan oluşturur. Tüm bu proteinler γ-H2AX ile doğrudan veya dolaylı bağlama yoluyla1,111,12ile birlikte lokalize dir.
Bu dna hasarı ve onarım uygun bir hassas test ile tespit etmek önemlidir, bu nedenle, daha fazla dikkat son derece hassas tekniklerin geliştirilmesi ne kadar ödenir13. DNA hasarı ve onarım çalışmaları bağlamında, metodoloji genom DNA hasarının hassas tespiti, hasar kategorisinin tanımlanması ve DNA hasar ve onarım mekanizmalarının sayısallaştırılması için çok önemlidir13. Hasarlı DNA’lı tek hücreleri tespit etmek için kuyruklu yıldız testi radyobiyolojik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır14. Diğer mevcut sitogenetik yöntemler, diysentrikler, translokasyonlar, asentrik parçalar, halkalar ve kromatit tip sapmaları ve mikronükleus kromozom hasarı (Mn) dahil olmak üzere kromozom sapmalarını tanır. Radyobiyolojide, özellikle biyolojik dozimetride en sık kullanılan yöntem, radyasyona özgüllüğü nedeniyle disantrik kromozomdosay’ıdır 15. Örneğin, klasik bir moleküler yöntem olan PCR, tespit edilen DNA hasarının türünü tanıyamaz. Bu durumda, immünometrik yöntemler duyarlılık seviyesini geçer çünkü reaksiyonlar antijen ve antikor arasında spesifiktir. İmmünofloresan görüntüleme, iyonlaştırıcı radyasyon gibi DNA zararlı ajanlara yanıt olarak farklı fosilerde farklı proteinlerin ortaya çıkması için görsel kanıtlar sağlar16. Ancak, hasar ve onarım proteinlerin mRNA düzeylerinin aktivasyon düzeyleri kolayca DNA hasar yanıtı bağlamında daha fazla moleküler çalışmalar için uygun bir kantitatif yöntemdir gerçek zamanlı PCR tarafından tespit edilebilir17.
Γ-H2AX foci onarım faktörleri çekmek dikkate alarak18, HÜCRESEL düzeyde DNA hasarı ve onarım izlemek için, biz güvenilir bir immünoresans boyama prosedürü geliştirdik, NHEJ yolu temsili onarım protein foci analizine dayalı (DNA-PKcs) ve RAD52 HRR yolu.
Burada, bu proteinler için immünoalgılamanın DNA-DSB indüksiyon ve onarımının izlenmesi için etkili ve hassas bir prosedür olarak kullanılmasını öneriyoruz. Şimdiye kadar, bnct için nötron karışık ışınlama sonra hücresel düzeyde onarım proteinlerinin foci dayalı DNA-DSBs üzerinde mevcut veri olmuştur, γ-H2AX ve 53BP1 belirteçleri hariç19. BIZ HCT-116 kolon kanseri hücre hattının adaptasyon öneririz, DSBs odak zengin kendisi olarak, DNA hasar analizi için standart bir hücre hattı olarak, RiFs kolayca tespit edilebilir çünkü. Bu yapışık hücre hattı bakımı kolaydır ve ışınlama prosedürleri için uygun. Önerilen prosedür γ-H2AX boyama genel immünofloresan prosedürü ile ilgili önceki çalışmaların büyük miktarda dayanmaktadır. Ancak, her onarım yoluna ait her temsili protein için test edilmiş seyreltme ile uygun antikorların seçimi ile ilgili tüm ayrıntıları içerir. Ayrıca, BNCT tedavisinde kullanılan benzersiz bir nötron-karışık ışın kullanımını açıklar. Ancak, her iki yöntem ile çalışmaları uzatmak için tavsiye, immünoresans boyama ilk ve daha sonra, daha önce yapılan yüksek maliyetli moleküler analiz ile4,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Γ-H2AX ve 53BP1 için immünokimyasal olarak boyanmış foksin frekansları radyobiyolojide yaygın olarak kullanılır ve DNA-DSB numarası ile ilişkilidir ve DNA-DSB’lerin indüksiyon ve onarımını izlemek için etkili ve hassas belirteçler olarak kabul edilir19. Γ-H2AX ve 53BP1’in ortak boyama prosedürü DNA-DSB’lerin tespiti için standart bir prosedürdür. γ-H2AX foci oluşumu 53BP1, DNA hasar yanıtı23bir regülatör işe ile ilişkilidir. Ancak, γ-H2AX /53…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nötron/gama radyasyonundan oluşan nötron karışımı ışınlara Polonya’daki Ulusal Nükleer Araştırma Merkezi’ndeki Maria araştırma reaktöründen erişildi. K.M.O. Polonya Ulusal Bilim Merkezi (Miniatura 2) tarafından #2018 desteklenmiştir.
Materials
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody – ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
References
- Carter, R. J., et al. Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).
- Kondo, N., et al. DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV. Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).
- Sakai, W., Sugasawa, K. DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair. DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , 155-174 (2016).
- Rodriguez, C., et al. In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line. Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).
- Sollazzo, A., et al. Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).
- Jeggo, P., Löbrich, M. Radiation-induced DNA damage responses. Radiation Protection Dosimetry. 122 (1-4), 124-127 (2006).
- Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54. The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).
- Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells. Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX – a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Sage, E., Shikazono, N. Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis. Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).
- Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: immunoassays in DNA damage and instability detection. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).
- Møller, P., et al. Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay. Mutagenesis. , (2020).
- Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).
- Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy. Methods. 48 (1), 63-71 (2009).
- Cheng, L., et al. Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes. PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Okumura, K., et al. Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells. Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).
- Dagrosa, M. A., et al. First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).
- Dagrosa, A., et al. Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer. Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).
- Reynolds, P., et al. The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage. Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).
- Rasche, L., et al. Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study. PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).
- Banáth, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).
- Barth, R. F., et al. Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer. Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).
- Mirzaei, H. R., et al. Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy. Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).
- Vitti, E. T., Parsons, J. L. The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair. Cancers. 11 (7), 946 (2019).
- Mohamad, O., et al. Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair. Cancers. 9 (6), 66 (2017).
