人类结肠癌细胞DNA损伤与修复福西的免疫荧光成像
Summary
在中子捕获治疗（BNCT）中使用的中子混合束激活的辐射诱导DNA损伤反应尚未完全确定。该协议提供了一个分步程序，通过使用中子混合束照射后，通过人体结肠癌细胞系中的免疫荧光染色来检测修复蛋白质的辐射诱导 foci （RIF）。
Abstract
手稿的目的是提供一个逐步的协议，用于执行免疫荧光显微镜，以研究中子-伽马混合束在波龙中子捕获疗法（BNCT）中使用的辐射诱导DNA损伤反应。具体来说，建议的方法用于检测修复蛋白活化，可以使用DNA双链断裂（DNA-DSB）特有的抗体，将修复蛋白活化结果可视化为活体。在与中子混合束照射后，通过结肠癌细胞（HCT-116）的免疫荧光评估DNA修复源。DNA-DSB 是最基因毒性病变，在哺乳动物细胞中通过两种主要途径进行修复：非同源端连接通路 （NHEJ） 和同源重组修复 （HRR）。53BP1 与 DNA-DSB 编号相关，是放射生物学中常用标记物（如 +-H2AX）常用的，其免疫化学染色频率被认为是监测DNA-DSB诱导和修复的高效敏感标记。确定 +-H2AX foci 吸引修复蛋白，导致 DSB 附近的修复因子浓度更高。为了监测细胞水平的DNA损伤，计划对来自NHEJ通路和RAD52的DNA-PKcs代表性修复蛋白来源的存在进行免疫荧光分析。我们开发并引入了可靠的免疫荧光染色方案，用于检测辐射诱发的DNA损伤反应，其抗体具有NHEJ和HRR通路修复因子的特异性，并观察到辐射诱导的致病（RIF）。该方法可用于研究中子混合束辐射时高度激活的修复蛋白，从而表明修复途径的主导地位。
Introduction
在中子捕获治疗（BNCT）中使用的中子混合束激活的辐射诱导DNA损伤反应尚未完全确定。该协议提供了一个分步程序，通过免疫荧光染色（例如，在与中子混合束照射后在人类结肠癌细胞系中）检测修复蛋白的辐射诱导 foci （RIF）。
电离辐射（IR）诱发多种不同类型的DNA损伤（DNA-DSB，DNA-SSB，DNA碱损伤），其中DNA双链断裂是最基因毒性的DNA病变1。未修复的断点可导致细胞死亡，而失修的断发则增加了染色体重新排列、变异和失去决定性遗传信息的概率。对 DSB 作出反应的损伤响应途径包括DNA修复途径，如非同源端连接（NHEJ），一种需要Ku 70/80、DNA+PKcs、Xrcc4和DNA连结酶IV作为关键因子,,2、3、4、5、635的机制6。24在哺乳动物中，第二个主要DNA修复途径是同源重组修复（HRR）通路，需要关键成分——Rad52 epistasis基因家族——Rad51、Rad52、Rad54、Rad55、Rad57和Rad587。Rad51 和 Rad54 是与真核生物复制应力和 DNA 断裂相关的修复机制中涉及的关键人类重组因素。有趣的是，观察到HRR通路的降低调节增强了NHEJ通路，它容易出现错误，指向与基因组稳定性相关的HR通路8。
DSB形成的第一步是α-H2AX组蛋白的磷酸化在Ser-139由阿塔夏泰朗吉西亚突变激酶（ATM）从PI3激酶家族7,7，8。有趣的是，H2AX磷酸化可以通过免疫荧光技术很容易地可视化为foci（+-H2AX foci），使用特异性磷酸化H2AX6抗体。DSB 的数量和 +-H2AX foci 之间有 1：1 的关系，因此，DSB 标记 α-H2AX 通过对 foci 形成、大小和数量 6、7、8、9、10、116,7,8,9,10的特性进行了广泛的研究。α-H2AX foci的形成导致DNA损伤反应（DDR）蛋白和染色质改变因子的招募和积累，例如53BP1（p53结合蛋白1）、MDC1（DNA损伤检查点的中介）、BRCA1、Mre11/Rad50/Nbs1、PARP-1和许多其他修复因子，从而形成辐射诱导的 foci（RIF）。所有这些蛋白质通过直接或间接结合1、11、12与+-H2AX,11共同结合。
通过适当的敏感测试来检测DNA损伤和修复是十分重要的，因此，要更加重视高精确技术的发展。在DNA损伤和修复研究的背景下，该方法对于基因组DNA损伤的敏感检测、损伤类别描述以及DNA损伤和修复机制的量化至关重要。为了检测DNA受损的单细胞，彗星测定在放射生物学研究中是常用的。其他可用的细胞遗传学方法可识别染色体畸变，包括二心、易位、中心片段、环和色度型畸变，以及微核染色体损伤 （Mn）。放射生物学中最常用的方法是多中心染色体测定，因为它对辐射的特异性很高。例如，PCR，一种经典的分子方法，无法识别检测到的DNA损伤的类型。在这种情况下，免疫测量方法通过敏感性水平，因为反应是特异性的抗原和抗体之间。免疫荧光成像为不同蛋白质在不同叶层的出现提供了视觉证据，以响应DNA损伤剂，如电离辐射16。然而，通过实时PCR很容易检测到损伤和修复蛋白mRNA水平的激活水平，这是DNA损伤反应17背景下进一步分子研究的正确定量方法。
考虑到 +-H2AX foci 吸引修复因子 18，以监测细胞水平的 DNA 损伤和修复，我们根据对 NHEJ 通路 （DNA-PKcs） 和 HRR 通路 Rad52 代表性修复蛋白 foci 的分析，开发出可靠的免疫荧光染色程序。
在这里，我们建议使用这些蛋白质的免疫检测作为监测DNA-DSB诱导和修复的高效和敏感的程序。到目前为止，除了+-H2AX和53BP1标记19外，还没有关于DNA-DSB的数据，这些数据基于BNCT中子混合束照射后细胞水平上修复蛋白的临界。我们建议对HCT-116结肠癌细胞系进行适应，因为它本身富含DSB foci，作为DNA损伤分析的标准细胞系，因为RIF很容易检测。这种粘附细胞系易于维护，适合辐照程序。建议的程序基于大量与+-H2AX染色的一般免疫荧光程序相关的先前研究。然而，它包括有关选择适当的抗体与测试稀释每个代表性蛋白质属于每个修复路径的所有细节。此外，它描述了BNCT治疗中独特的中子混合光束的利用。然而，我们建议扩大研究与这两种方法，免疫荧光染色第一，然后，与高成本分子分析之前执行4,4，17。
Protocol
Representative Results
Discussion
α-H2AX和53BP1的源点、免疫化学染色频率常用于放射生物学，与DNA-DSB编号相关，被认为是监测DNA-DSB19诱导和修复的高效敏感标记。+-H2AX 和 53BP1 的共染色程序是检测 DNA-DSB 的标准程序。 α-H2AX foci 的形成与 53BP1 的招募有关，53BP1 是 DNA 损伤反应的调节器23。然而，不同的细胞系在 +-H2AX /53BP1 foci 11 的背景水平可能有所不同。已经证明，+-H2AX …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
由中子/伽马辐射组成的中子混合束从波兰国家核研究中心的玛丽亚研究反应堆进入。K.M.O.得到波兰国家科学中心（Miniatura 2）第#2018/02/X/NZ5/02849号赠款的支持。
Materials
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody – ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
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