Immunofluorescentie beeldvorming van DNA Schade en Reparatie Foci in human Colon Kankercellen
Summary
De door straling veroorzaakte DNA-schaderespons die wordt geactiveerd door neutronenmixstraal die wordt gebruikt in de boorneutronvangtherapie (BNCT) is nog niet volledig vastgesteld. Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure voor het detecteren van door straling geïnduceerde foci (RIF) van reparatie-eiwitten door immunofluorescentie kleuring in menselijke darmkankercellijnen na bestraling met de neutronen gemengde straal.
Abstract
Het doel van het manuscript is om een stapsgezind protocol te bieden voor het uitvoeren van immunofluorescentiemicroscopie om de door straling geïnduceerde DNA-schaderespons te bestuderen die wordt veroorzaakt door neutronengamma mixed-beam die wordt gebruikt in boor neutronenvangsttherapie (BNCT). In het bijzonder wordt de voorgestelde methode toegepast voor de detectie van activering van reparatie-eiwitten, die als foci kan worden gevisualiseerd met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor DNA-dubbelstrengbreuken (DNA-DSB’s). DNA-herstel foci werden beoordeeld door immunofluorescentie in darmkankercellen (HCT-116) na bestraling met de neutronen gemengde straal. DNA-DSB’s zijn de meest genotoxische laesies en worden in zoogdiercellen hersteld door twee belangrijke trajecten: niet-homologe end-joining pathway (NHEJ) en homologe recombinatiereparatie (HRR). De frequenties van foci, immunochemisch gekleurd, voor veelgebruikte markers in de radiobiologie zoals γ-H2AX, 53BP1 worden geassocieerd met DNA-DSB-nummer en worden beschouwd als efficiënte en gevoelige markers voor het toezicht op de inductie en reparatie van DNA-DSB’s. Vastgesteld werd dat γ-H2AX foci reparatieeiwitten aantrekt, wat leidt tot een hogere concentratie van reparatiefactoren in de buurt van een DSB. Om DNA-schade op cellulair niveau te monitoren, werd immunofluorescentieanalyse gepland voor de aanwezigheid van DNA-PKcs representatieve reparatieeiwitfoci van het NHEJ-traject en Rad52 van het HRR-traject. We hebben een betrouwbaar immunofluorescentie-kleuringsprotocol ontwikkeld en geïntroduceerd voor de detectie van door straling geïnduceerde DNA-schaderespons met antilichamen die specifiek zijn voor herstelfactoren van NHEJ- en HRR-trajecten en waargenomen door straling geïnduceerde foci (RIF). De voorgestelde methode kan worden gebruikt voor het onderzoek naar reparatie-eiwit dat sterk wordt geactiveerd in het geval van neutronen-gemengde straalstraling, wat de dominantie van het reparatietraject aangeeft.
Introduction
De door straling veroorzaakte DNA-schaderespons die wordt geactiveerd door neutronenmixstraal die wordt gebruikt in de boorneutronvangtherapie (BNCT) is nog niet volledig vastgesteld. Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure voor het uitvoeren van de detectie van door straling geïnduceerde foci (RIF) van reparatie-eiwitten door immunofluorescentie-vlekken, bijvoorbeeld in de cellijn van darmkanker bij de menselijke darmkanker na bestraling met de neutronen gemengde straal.
Ioniserende straling (IR) veroorzaakt een veelheid van verschillende soorten DNA-schade (DNA-DSB’s, DNA-SSB’s, DNA-basisschade) waaruit DNA-dubbelstrengbreuken de meest genotoxische DNA-laesies zijn1. Niet-gerepareerde breuken kunnen celdood veroorzaken, terwijl verkeerd gerepareerde pauzes de kans op chromosoomherschikking, mutagenese en verlies van beslissende genetische informatie verhoogt. De schade respons trajecten reageren op DSB’s omvatten trajecten van DNA-reparatie, zoals niet-homologe end joining (NHEJ), een mechanisme dat vereist Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4, en DNA ligase IV als belangrijke factoren2,3,4,5,6. Bij zoogdieren is de tweede belangrijkste DNA-reparatieroute homologe recombinatiereparatie (HRR) die belangrijke componenten vereist – de Rad52 epistasis genfamilie- Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 en Rad587. Rad51 en Rad54 zijn belangrijke menselijke recombinatiefactoren die betrokken zijn bij reparatiemechanismen die verband houden met de replicatiestress en DNA-breuken in eukaryoten. Interessant is dat de downregulatie van de HRR-route het NHEJ-pad verbetert, wat foutgevoelig is en wijst op de relevantie van hr-paden voor de genoomstabiliteit8.
De eerste stap van DSB’s vorming is de fosforylatie van de γ-H2AX histone bij Ser-139 door Ataxia telangiectasia gemuteerde kinase (ATM) uit de PI3 kinase familie7,8. Interessant is dat H2AX fosforylatie gemakkelijk kan worden gevisualiseerd door immunofluorescentie techniek als foci (γ-H2AX foci) met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor fosforyleerde H2AX6. Er is een 1:1 relatie tussen het aantal DSB’s en γ-H2AX foci, daarom wordt DSB marker, γ-H2AX, uitgebreid bestudeerd door de karakterisering van focivorming, grootte en hoeveelheid6,7,8,9,10,11. Vorming van γ-H2AX foci leidt tot de rekrutering en accumulatie van DNA-schaderespons (DDR) eiwitten en chromatine-modificerende factoren, zoals 53BP1 (p53 binding protein 1), MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1 en vele anderen repareren factoren waardoor stralingsgeïduceerde foci (RIF) ontstaat. Al deze eiwitten colokeren met γ-H2AX via directe of indirecte binding1,11,12.
Het is belangrijk om DNA-schade en reparatie op te sporen met een goede gevoelige test, daarom wordt meer aandacht besteed aan de ontwikkeling van zeer nauwkeurige technieken13. In het kader van DNA-schade- en herstelstudies is de methodologie cruciaal voor de gevoelige detectie van genoom-DNA-schade, beschrijving van de schadecategorie en kwantificering van DNA-schade- en reparatiemechanismen13. Om enkele cellen met beschadigd DNA te detecteren, wordt komeettest vaak gebruikt in radiobiologische studies14. Andere beschikbare cytogenetische methoden herkennen chromosomale afwijkingen, waaronder dicentrics, translocaties, acentrische fragmenten, ringen en chromatiïdentypeafwijkingen en micronucleuschromosomale schade (Mn). De meest gebruikte methode in de radiobiologie, vooral in biologische dosimetrie, is de dicentric chromosoomtest vanwege de hoge specificiteit voor straling15. PCR, een klassieke moleculaire methode, kan bijvoorbeeld het type gedetecteerde DNA-schade niet herkennen. In dit geval passeren de immunometrische methoden het gevoeligheidsniveau omdat de reacties specifiek zijn tussen het antigeen en het antilichaam. Immunofluorescentie beeldvorming levert visueel bewijs voor het verschijnen van verschillende eiwitten in verschillende foci in reactie op DNA-schadelijke stoffen zoals ioniserende straling16. De activeringsniveaus van de mRNA-niveaus van schade en reparatieeiwitten zijn echter gemakkelijk te detecteren door real-time PCR, wat een goede kwantitatieve methode is voor verdere moleculaire studies in het kader van DNA-schaderespons17.
Rekening houdend met het feit dat γ-H2AX foci reparatiefactoren18aantrekt , om DNA-schade en -herstel op cellulair niveau te monitoren, hebben we een betrouwbare immunofluorescentie-kleuringsprocedure ontwikkeld, gebaseerd op de analyse van de representatieve reparatieeiwitfoci uit het NHEJ-traject (DNA-PKcs) en Rad52 van het HRR-traject.
Hier stellen we het gebruik van immunodetetie voor deze eiwitten voor als de efficiënte en gevoelige procedure voor het monitoren van DNA-DSB inductie en reparatie. Tot nu toe waren er geen gegevens beschikbaar over DNA-DSB’s op basis van foci van reparatie-eiwitten op cellulair niveau na de neutronenmixstraalbestraling voor BNCT, behalve γ-H2AX en 53BP1-markers19. Wij stellen de aanpassing van de HCT-116 darmkankercellijn voor, omdat deze zelf rijk is aan DSBs-foci, als een standaardcellijn voor DNA-schadeanalyse, omdat RIF’s gemakkelijk detecteerbaar zijn. Deze aanhangende cellijn is eenvoudig te onderhouden en geschikt voor bestralingsprocedures. De voorgestelde procedure is gebaseerd op een enorme hoeveelheid eerdere studies met betrekking tot de algemene immunofluorescentieprocedure van γ-H2AX-kleuring. Het bevat echter alle details met betrekking tot de selectie van geschikte antilichamen met geteste verdunningen voor elk representatief eiwit dat tot elke reparatieroute behoort. Bovendien beschrijft het het gebruik van een unieke neutronen gemengde bundel gebruikt in BNCT therapie. We raden echter aan om de studies uit te breiden met beide methoden, immunofluorescentie kleuring eerst en vervolgens, met high-cost moleculaire analyse zoals eerder uitgevoerd4,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
De frequenties van foci, immunochemisch gekleurd voor γ-H2AX en 53BP1 worden vaak gebruikt in de radiobiologie en worden geassocieerd met DNA-DSB-nummer en worden beschouwd als efficiënte en gevoelige markers voor het toezicht op de inductie en reparatie van DNA-DSB’s19. De co-kleuringsprocedure van γ-H2AX en 53BP1 is een standaardprocedure voor de detectie van DNA-DSB’s. Vorming van γ-H2AX foci wordt geassocieerd met de aanwerving van 53BP1, een regulator van de DNA-schaderespons<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Neutronen-gemengde straal bestaande uit neutronen / gammastraling werd benaderd vanuit de Maria onderzoeksreactor in het National Centre for Nuclear Research in Polen. K.M.O. werd ondersteund door het National Science Centre, Polen (Miniatura 2) grant no. #2018/02/X/NZ5/02849.
Materials
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody – ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
References
- Carter, R. J., et al. Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).
- Kondo, N., et al. DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV. Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).
- Sakai, W., Sugasawa, K. DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair. DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , 155-174 (2016).
- Rodriguez, C., et al. In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line. Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).
- Sollazzo, A., et al. Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).
- Jeggo, P., Löbrich, M. Radiation-induced DNA damage responses. Radiation Protection Dosimetry. 122 (1-4), 124-127 (2006).
- Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54. The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).
- Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells. Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX – a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Sage, E., Shikazono, N. Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis. Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).
- Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: immunoassays in DNA damage and instability detection. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).
- Møller, P., et al. Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay. Mutagenesis. , (2020).
- Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).
- Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy. Methods. 48 (1), 63-71 (2009).
- Cheng, L., et al. Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes. PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Okumura, K., et al. Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells. Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).
- Dagrosa, M. A., et al. First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).
- Dagrosa, A., et al. Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer. Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).
- Reynolds, P., et al. The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage. Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).
- Rasche, L., et al. Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study. PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).
- Banáth, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).
- Barth, R. F., et al. Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer. Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).
- Mirzaei, H. R., et al. Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy. Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).
- Vitti, E. T., Parsons, J. L. The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair. Cancers. 11 (7), 946 (2019).
- Mohamad, O., et al. Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair. Cancers. 9 (6), 66 (2017).
