인간 결장 암 세포에 있는 DNA 손상 및 복구 Foci의 면역 형광 화상 진찰
Summary
붕소 중성자 포획 요법(BNCT)에 사용되는 중성자 혼합빔에 의해 활성화된 방사선 유도 DNA 손상 반응은 완전히 확립되지 않았다. 이 프로토콜은 중성자 혼합 빔으로 조사 한 후 인간 대장암 세포주에서 면역 형광 염색에 의해 수리 단백질의 방사선 유도 포시 (RIF)를 검출하는 단계별 절차를 제공합니다.
Abstract
원고의 목적은 붕소 중성자 포획 요법(BNCT)에 사용되는 중성자 감마 혼합빔에 의해 유도된 방사선 유도 DNA 손상 반응을 연구하기 위해 면역형광 현미경 검사를 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제공하는 것이다. 구체적으로, 제안된 방법론은 DNA 이중 가닥 휴식(DNA-DSBs)에 특이적인 항체를 사용하여 포시로 시각화될 수 있는 수리 단백질 활성화의 검출을 위해 적용된다. DNA 복구 포시는 중성자 혼합 빔으로 조사 한 후 결장 암 세포 (HCT-116)에서 면역 형광에 의해 평가되었다. DNA-DSB는 가장 유독성 병변이며 두 가지 주요 경로에 의해 포유류 세포에서 수리됩니다: 비 동형 최종 결합 경로 (NHEJ) 및 상동성 재조합 수리 (HRR). 국소, 면역화학적으로 염색된 포시의 주파수는 γ-H2AX와 같은 방사선 생물학에서 일반적으로 사용되는 마커를 위해, 53BP1은 DNA-DSB 번호와 연관되고 DNA-DSB의 유도 및 수리를 감시하기 위한 효율적이고 민감한 마커로 간주됩니다. γ-H2AX 포시가 수리 단백질을 유치하여 DSB 근처의 고농도의 수리 인자를 유도한다는 것이 확립되었습니다. 세포 수준에서 DNA 손상을 모니터링하기 위해, HRR 통로로부터 의 DNA-PKcs 대표 수리 단백질 포시의 존재를 위한 면역형광 분석및 HRR 통로로부터 Rad52가 계획되었다. NHEJ 및 HRR 경로및 관찰된 방사선 유도 포시(RIF)로부터의 수리 인자에 특이적인 항체를 이용한 방사선 유도 DNA 손상 반응의 검출을 위한 신뢰할 수 있는 면역형 염색 프로토콜을 개발 및 도입했습니다. 제안된 방법론은 중성자 혼합 빔 방사선의 경우 고도로 활성화되는 수리 단백질을 조사하는 데 사용될 수 있으며, 이로 인해 수리 경로의 지배력을 나타낸다.
Introduction
붕소 중성자 포획 요법(BNCT)에 사용되는 중성자 혼합빔에 의해 활성화된 방사선 유도 DNA 손상 반응은 완전히 결정되지 않았다. 이러한 프로토콜은 중성자 혼합 빔을 조사한 후 인간 대장암 세포주에서 면역형 염색에 의한 수리 단백질의 방사선 유도 포시(RIF)의 검출을 수행하기 위한 단계별 절차를 제공한다.
이온화 방사선(IR)은 DNA 이중 가닥 휴식이 가장 유전자 독성 DNA 병변1인DNA 손상(DNA-DSBs, DNA-SSBs, DNA 기지 손상)의 다양한 유형의 DNA 손상을 유도한다. 수리되지 않은 휴식은 세포 사망을 일으킬 수 있으며, 잘못 수리된 휴식은 염색체 재배열, 돌연변이 발생 및 결정적인 유전 정보의 손실 가능성을 높입니다. DSB에 반응하는 손상 반응 경로는 비 동형 종조 (NHEJ) 같은 DNA 수리의 경로를 포함, Ku 70/80을 필요로하는 메커니즘, DNA -PKcs, Xrcc4, DNA 리개세 IV주요 요인으로22,3,,4,,5,,6. 포유류에서, 두 번째 주요 DNA 수리 경로는 주요 구성 요소를 필요로 동종 재조합 수리 (HRR) 경로 – Rad52 에피스타시스 유전자 가족 – Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 및 Rad587. Rad51 및 Rad54는 진핵생물의 복제 스트레스 및 DNA 파손과 관련된 수리 메커니즘에 관여하는 주요 인간 재조합 요소입니다. 흥미롭게도, HRR 통로의 다운규제는 게놈 안정성에 대한 HR 통로 관련성을 가리키는 오류가 발생하기 쉬운 NHEJ 통로를 향상시키는 것으로 관찰되었다8.
DSB의 형성의 첫 번째 단계는 PI3 키나아제 패밀리7,,8에서알로카 텔란지크시아 돌연변이 키나아제(ATM)에 의해 Ser-139에서 γ-H2AX 히스톤의 인광이다. 흥미롭게도, H2AX 인산화는 인광H2AX6에특이적 항체를 사용하여 포시(γ-H2AX foci)로서 면역형광 기술에 의해 쉽게 시각화될 수 있다. DSB와 γ-H2AX 포시의 수 사이에 는 1:1 관계가 있기 때문에, DSB 마커, γ-H2AX는, 포시 형성, 크기 및 수량6,,7,,8,,9,,10,,11의특성화를 통해 광범위하게 연구된다. γ-H2AX 포시의 형성은 53BP1(p53 결합 단백질 1), MDC1(DNA 손상 체크포인트의 중재자), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, 및 많은 수산 계보(이와 같은 DNA 손상 반응)의 모집 및 축적으로 이어집니다. 이러한 모든 단백질은 직간접 결합1,,11,12를통해 γ-H2AX와 공동 국한한다.,
적절한 민감한 검사를 통해 DNA 손상을 감지하고 수리하는 것이 중요하므로, 고정밀 기술의 개발에 더 많은 주의를기울인다(13). DNA 손상 및 수리 연구의 맥락에서, 방법론은 게놈 DNA 손상의 민감한 검출, 손상 범주의 설명 및 DNA 손상 및 수리 메커니즘의 정량화에 매우 중요하다13. 손상된 DNA를 가진 단 하나 세포를 검출하기 위하여는, 혜성 분석은 방사선 생물학 연구결과 14에서일반적으로 이용됩니다. 다른 사용 가능한 세포 유전학 방법은 다심루, 전좌, 심심 단편, 고리 및 크로마티드 형 수차 및 미세 핵 염색체 손상(Mn)을 포함한 염색체 수차를 인식합니다. 방사선 생물학에서 가장 자주 사용되는 방법은, 특히 생물학적 도시계에서, 방사선 에 대한 높은 특이성으로 인한 심루 염색체 분석이다15. 예를 들어, 고전적인 분자 방법인 PCR은 검출된 DNA 손상의 유형을 인식할 수 없습니다. 이 경우, 면역측정 방법은 반응이 항원과 항체 사이에 특이적이기 때문에 감도 수준을 통과한다. 면역 형광 화상 진찰은 이온화 방사선16같이 DNA 손상 에이전트에 응하여 구별되는 foci에 있는 다른 단백질의 외관을 위한 시각적인 증거를 제공합니다. 그러나, 손상 및 수리 단백질의 mRNA 수준의 활성화 수준은 DNA 손상 반응반응(17)의맥락에서 추가 분자 연구를 위한 적절한 정량적 방법이되는 실시간 PCR에 의해 쉽게 검출할 수 있다.
γ-H2AX 포시가 수리인자(18)를유치하고, 세포 수준에서 DNA 손상 및 수리를 모니터링하는 것을 고려하여, HRR 통로에서 NHEJ 통로(DNA-PKcs)와 Rad52로부터 대표적인 수리 단백질 포치의 분석을 기반으로 신뢰할 수 있는 면역형 플루오레스 염색 절차를 개발했습니다.
여기에서, 우리는 DNA-DSB 유도 및 수리를 감시하기 위한 효율적이고 민감한 절차로 이 단백질을 위한 면역 검출의 사용을 제안합니다. 지금까지, Γ-H2AX 및 53BP1 마커19를제외하고 BNCT에 대한 중성자 혼합 빔 조사 후 세포 수준에서 수리 단백질의 초점에 기초하여 DNA-DSBs에 대한 사용 가능한 데이터가 없었다. 우리는 HCT-116 결장암 세포주의 적응을 건의합니다, 그것은 DSBs foci에서 풍부하기 때문에, DNA 손상 분석을 위한 표준 세포주로서, RIF는 쉽게 검출하기 때문에. 이 부착 된 세포주 유지 하기 쉽고 조사 절차에 대 한 적절 한. 제안된 절차는 γ-H2AX 염색의 일반적인 면역 형광 절차와 관련된 이전 연구의 거대한 양을 기반으로합니다. 그러나, 각 수리 경로에 속하는 각 대표적인 단백질에 대해 테스트된 희석을 가진 적절한 항체의 선택에 관한 모든 세부 사항을 포함한다. 더욱이, BNCT 치료에 사용되는 독특한 중성자 혼합 빔의 활용을 설명합니다. 그러나,이전에,수행된 바와 같이 고비용 분자 분석을 통해 두 가지 방법, 면역형광 염색을 먼저 연장하는 것이좋습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
포시의 주파수, γ-H2AX 및 53BP1을 위해 면역화학적으로 염색된 것은 방사선생물학에서 일반적으로 사용되며 DNA-DSB 번호와 연관되며 DNA-DSB(19)의 유도 및19수리를 모니터링하기 위한 효율적이고 민감한 마커로 간주됩니다. γ-H2AX 및 53BP1의 공동 염색 절차는 DNA-DSBs의 검출을 위한 표준 절차입니다.23 그러나, 상이한 세포주(γ-H2AX/53BP1 foci 11)의배경 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
중성자/감마 방사선으로 구성된 중성자 혼합 빔은 폴란드 국립 핵연구 센터의 마리아 연구 원자로에서 접근했다. K.M.O.는 폴란드 국립 과학 센터(Miniatura 2)가 #2018/02/X/NZ5/02849를 지원받았습니다.
Materials
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody – ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
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