Immunfluoreszenz Bildgebung von DNA-Schäden und Reparatur-Fozien in menschlichen Darmkrebszellen
Summary
Die strahlungsinduzierte DNA-Schadensreaktion, die durch Neutronen-Mischstrahl aktiviert wird, das in der Bor-Neutronen-Capture-Therapie (BNCT) verwendet wird, ist nicht vollständig etabliert. Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren zum Nachweis von strahlungsinduzierten Brennpunkten (RIF) von Reparaturproteinen durch Immunfluoreszenzfärbung in menschlichen Darmkrebszelllinien nach Bestrahlung mit dem Neutronenmischstrahl.
Abstract
Der Zweck des Manuskripts ist es, ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Durchführung von Immunfluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der strahlungsinduzierten DNA-Schadensreaktion durch Neutronen-Gamma-Mischstrahl in der Bor-Neutronen-Capture-Therapie (BNCT) zu untersuchen. Insbesondere wird die vorgeschlagene Methode für den Nachweis der Aktivierung von Reparaturproteinen angewendet, die als Brennpunkte unter Verwendung von Antikörpern visualisiert werden können, die für DNA-Doppelstrangbrüche (DNA-DSBs) spezifisch sind. DNA-Reparaturherde wurden durch Immunfluoreszenz in Dickdarmkrebszellen (HCT-116) nach Bestrahlung mit dem Neutronen-Mischstrahl untersucht. DNA-DSBs sind die genotoxischesten Läsionen und werden in Säugetierzellen durch zwei Hauptwege repariert: nicht-homologe Endverbindungsweg (NHEJ) und homologe Rekombinationsreparatur (HRR). Die Frequenzen von brennpunkten, immunochemisch gefärbten, für häufig verwendete Marker in der Radiobiologie wie z.B. H2AX, 53BP1 sind mit der DNA-DSB-Nummer assoziiert und gelten als effiziente und empfindliche Marker zur Überwachung der Induktion und Reparatur von DNA-DSBs. Es wurde festgestellt, dass H2AX-Brennpunkte Reparaturproteine anziehen, was zu einer höheren Konzentration von Reparaturfaktoren in der Nähe eines DSB führt. Um DNA-Schäden auf zellulärer Ebene zu überwachen, wurde eine Immunfluoreszenzanalyse für das Vorhandensein von DNA-PKcs repräsentativen Reparaturprotein-Foci aus dem NHEJ-Signal und Rad52 aus dem HRR-Signal weg geplant. Wir haben ein zuverlässiges Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll für den Nachweis der strahlungsinduzierten DNA-Schadensreaktion mit Antikörpern entwickelt und eingeführt, die speziell für Reparaturfaktoren aus NHEJ- und HRR-Signalwegen und beobachteten strahlungsinduzierten Brennpunkten (RIF) bestimmt sind. Die vorgeschlagene Methode kann zur Untersuchung von Reparaturproteinen verwendet werden, die bei Neutronen-gemischter Strahlstrahlung stark aktiviert sind, wodurch die Dominanz des Reparaturwegs angezeigt wird.
Introduction
Die strahlungsinduzierte DNA-Schadensreaktion, die durch Neutronenmischstrahl aktiviert wird, der in der Bor-Neutronen-Capture-Therapie (BNCT) verwendet wird, wurde nicht vollständig bestimmt. Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren zum Nachweis von strahlungsinduzierten Brennpunkten (RIF) von Reparaturproteinen durch Immunfluoreszenzfärbung z.B. in der menschlichen Darmkrebszelllinie nach Bestrahlung mit dem Neutronenmischstrahl.
Ionisierende Strahlung (IR) induziert eine Vielzahl von verschiedenen Arten von DNA-Schäden (DNA-DSBs, DNA-SSBs, DNA-Base-Schäden), aus denen DNA-Doppelstrangbrüche die genotoxischesten DNA-Läsionen sind1. Unreparierte Brüche können zum Zelltod führen, während falsch reparierte Brüche die Wahrscheinlichkeit einer Chromosomenumlagerung, Mutagenese und des Verlusts entscheidender genetischer Informationen erhöhen. Die Schadensreaktionswege, die auf DSBs reagieren, umfassen Wege der DNA-Reparatur wie nicht-homologe Endverbindung (NHEJ), ein Mechanismus, der Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4 und DNA Ligase IV als Schlüsselfaktoren2,3,4,5,6erfordert. Bei Säugetieren ist der zweite Haupt-DNA-Reparaturweg der homologe Rekombinationsreparaturweg (HRR), der Schlüsselkomponenten erfordert – die Rad52 Epistasis-Genfamilie – Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 und Rad587. Rad51 und Rad54 sind wichtige menschliche Rekombinationsfaktoren, die an Reparaturmechanismen im Zusammenhang mit dem Replikationsstress und DNA-Brüchen in Eukaryoten beteiligt sind. Interessanterweise wurde beobachtet, dass die Downregulation des HRR-Signalwegs den NHEJ-Signal weg verbessert, der fehleranfällig ist und auf die HR-Signalwegrelevanz für die Genomstabilität8zeigt.
Der erste Schritt der DSBs-Bildung ist die Phosphorylierung des Histons von Ser-139 bei Ser-139 durch Ataxia telangiectasia mutierte Kinase (ATM) aus der PI3-Kinase-Familie7,8. Interessanterweise kann die H2AX-Phosphorylierung einfach durch Immunfluoreszenztechnik als Brennpunkte visualisiert werden, indem Antikörper verwendet werden, die speziell für phosphorylierte H2AX6sind. Es besteht eine 1:1-Beziehung zwischen der Anzahl der DSBs und den H2AX-Brennpunkten, daher wird der DSB-Marker, der -H2AX, ausgiebig durch die Charakterisierung von Foci-Bildung, Größe und Menge6,,7,,8,9,10,11untersucht. Die Bildung von H2AX-Brennpunkten führt zur Rekrutierung und Akkumulation von DNA-Schadensreaktionsproteinen (DDR)-Proteinen und chromatinmodifizierenden Faktoren, wie 53BP1 (p53-bindendes Protein 1), MDC1 (Mediator des DNA-Schadens-Checkpoints), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1 und vielen anderen Reparaturfaktoren, die so strahlungsinduzierte Foci (RIF) bilden. Alle diese Proteine kolokalisieren mit dem H2AX durch direkte oder indirekte Bindung1,11,12.
Es ist wichtig, DNA-Schäden zu erkennen und mit einem richtigen empfindlichen Test zu reparieren, daher wird mehr Aufmerksamkeit auf die Entwicklung hochpräziser Techniken geachtet13. Im Zusammenhang mit DNA-Schäden und Reparaturstudien ist die Methodik entscheidend für den sensiblen Nachweis von Genom-DNA-Schäden, die Beschreibung der Schadenskategorie und die Quantifizierung von DNA-Schäden und Reparaturmechanismen13. Um einzelne Zellen mit beschädigter DNA zu erkennen, wird Kometenassay häufig in radiobiologischen Studien verwendet14. Andere verfügbare zytogenetische Methoden erkennen chromosomale Aberrationen, einschließlich Dizentrik, Translokationen, azentrische Fragmente, Ringe und chromatidartige Aberrationen und mikronukleus chromosomale Schäden (Mn). Die am häufigsten verwendete Methode in der Radiobiologie, insbesondere in der biologischen Dosimetrie, ist der dizentrische Chromosomentest aufgrund seiner hohen Spezifität für Strahlung15. Beispielsweise kann PCR, eine klassische molekulare Methode, die Art der nachgewiesenen DNA-Schäden nicht erkennen. In diesem Fall übergeben die immunmetrischen Methoden den Sensitivitätsgrad, da die Reaktionen zwischen dem Antigen und dem Antikörper spezifisch sind. Immunfluoreszenz-Bildgebung liefert visuelle Beweise für das Auftreten verschiedener Proteine in unterschiedlichen Brennpunkten als Reaktion auf DNA-schädliche Wirkstoffe wie ionisierende Strahlung16. Die Aktivierungsniveaus von Schäden und Reparaturproteinen mRNA-Spiegel sind jedoch leicht durch Echtzeit-PCR nachweisbar, die eine richtige quantitative Methode für weitere molekulare Studien im Kontext der DNA-Schadensreaktion17ist.
Unter Berücksichtigung der Berücksichtigung der Reparaturfaktoren18, um die DNA-Schäden und die Reparatur auf zellulärer Ebene zu überwachen, haben wir ein zuverlässiges Immunfluoreszenz-Färbeverfahren entwickelt, das auf der Analyse der repräsentativen Reparaturproteinheris aus dem NHEJ-Signalweg (DNA-PKcs) und Rad52 aus dem HRR-Signalweg basiert.
Hier schlagen wir die Verwendung von Immundetektion für diese Proteine als effizientes und empfindliches Verfahren zur Überwachung der DNA-DSB-Induktion und -Reparatur vor. Bisher liegen keine Daten über DNA-DSBs vor, die auf Brennpunkten von Reparaturproteinen auf zellulärer Ebene nach der Neutronen-Mischstrahlbestrahlung für BNCT basieren, mit Ausnahme von H2AX- und 53BP1-Markern19. Wir schlagen die Anpassung der HCT-116 Darmkrebszelllinie, da sie selbst reich an DSBs-Brennpunkten ist, als Standard-Zelllinie für die DNA-Schadensanalyse vor, da RIFs leicht nachweisbar sind. Diese haftende Zelllinie ist einfach zu pflegen und für Bestrahlungsverfahren angemessen. Das vorgeschlagene Verfahren basiert auf einer Vielzahl früherer Studien im Zusammenhang mit dem allgemeinen Immunfluoreszenzverfahren der Färbung von H2AX. Es enthält jedoch alle Details bezüglich der Auswahl geeigneter Antikörper mit getesteten Verdünnungen für jedes repräsentative Protein, das zu jedem Reparaturweg gehört. Darüber hinaus beschreibt es die Verwendung eines einzigartigen Neutronen-Mischstrahls, der in der BNCT-Therapie eingesetzt wird. Wir empfehlen jedoch, die Studien mit beiden Methoden zu erweitern, zunächst immunfluoreszenzfärbung und dann, mit kostenhoher molekularer Analyse, wie zuvordurchgeführt 4,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Frequenzen von Brennpunkten, immunochemisch gefärbt für H2AX und 53BP1 werden häufig in der Radiobiologie verwendet und sind mit der DNA-DSB-Nummer assoziiert und gelten als effiziente und empfindliche Marker zur Überwachung der Induktion und Reparatur von DNA-DSBs19. Das Co-Färbungsverfahren von H2AX und 53BP1 ist ein Standardverfahren zum Nachweis von DNA-DSBs. Die Bildung von H2AX-Schwerpunkten ist mit der Rekrutierung von 53BP1, einem Regulator der DNA-Schadensreaktion<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Neutronenmischstrahl aus Neutronen-Gamma-Strahlung wurde aus dem Forschungsreaktor Maria im Nationalen Zentrum für Kernforschung in Polen abgerufen. K.M.O. wurde vom National Science Centre, Polen (Miniatura 2) Stipendium Nr. #2018/02/X/NZ5/02849 unterstützt.
Materials
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody – ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
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