Imagens de imunofluorescência de dna dano e reparo de focos em células cancerígenas de cólon humano
Summary
A resposta de dano de DNA induzida por radiação ativada pelo feixe misto de nêutrons usado na terapia de captura de nêutrons de boro (BNCT) não foi totalmente estabelecida. Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para detectar focos induzidos por radiação (RIF) de proteínas de reparação por manchas de imunofluorescência em linhas de células cancerígenas de cólon humano após a irradiação com o feixe misturado de nêutrons.
Abstract
O objetivo do manuscrito é fornecer um protocolo passo-a-passo para a realização de microscopia de imunofluorescência para estudar a resposta de dano de DNA induzida por radiação induzida pelo feixe misto de nêutrons usado na terapia de captura de nêutrons de boro (BNCT). Especificamente, a metodologia proposta é aplicada para a detecção de ativação de proteínas de reparo que podem ser visualizadas como focos usando anticorpos específicos para quebras de dupla cadeia de DNA (DNA-DSBs). Os focos de reparação de DNA foram avaliados por imunofluorescência em células cancerígenas de cólon (HCT-116) após irradiação com o feixe misto de nêutrons. Os DNA-DSBs são as lesões mais genotoxiicas e são reparados em células mamíferas por duas vias principais: via final não homólogo (NHEJ) e reparação de recombinação homologos (HRR). As frequências de focos, imunoquimicamente manchadas, para marcadores comumente usados em radiobiologia como γ-H2AX, 53BP1 estão associadas ao número DNA-DSB e são consideradas como marcadores eficientes e sensíveis para monitorar a indução e reparação de DNA-DSBs. Foi estabelecido que os focos γ-H2AX atraem proteínas de reparo, levando a uma maior concentração de fatores de reparo perto de um DSB. Para monitorar os danos do DNA no nível celular, foi planejada a análise de imunofluorescência para a presença de focos proteicos de reparação representativos de DNA-PKcs da via NHEJ e Rad52 da via HRR. Desenvolvemos e introduzimos um protocolo confiável de coloração de imunofluorescência confiável para a detecção de resposta a danos de DNA induzido por radiação com anticorpos específicos para fatores de reparo das vias NHEJ e HRR e focos induzidos por radiação (RIF). A metodologia proposta pode ser usada para investigar proteínas de reparo altamente ativadas no caso de radiação de feixe misturado de nêutrons, indicando assim o domínio da via de reparo.
Introduction
A resposta de dano de DNA induzida por radiação ativada pelo feixe misto de nêutrons usado na terapia de captura de nêutrons de boro (BNCT) não foi totalmente determinada. Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para realizar a detecção de focos induzidos por radiação (RIF) de proteínas de reparação por manchas de imunofluorescência, por exemplo, na linha de células cancerígenas de cólon humano após a irradiação com o feixe misturado de nêutrons.
A radiação ionizante (IR) induz uma infinidade de diferentes tipos de dano de DNA (DNA-DSBs, DNA-SSBs, dano à base de DNA) dos quais as quebras de DNA duplo são as lesões de DNA mais genoóxicos1. Quebras não reparadas podem causar morte celular, enquanto quebras mal reparadas aumentam a probabilidade de rearranjo de cromossomo, mutagênese e perda de informações genéticas decisivas. As vias de resposta a danos que respondem aos DSBs incluem caminhos de reparação de DNA como a junção final não homólogo (NHEJ), um mecanismo que requer Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4 e DNA ligase IV como fatores-chave2,3,,4,,5,6. Nos mamíferos, a segunda principal via de reparação de DNA é a via de reparação de recombinação homologou (HRR), que requer componentes-chave – a família genética Rad52 epistasis – Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57, Rad57 e Rad587. Rad51 e Rad54 são os principais fatores de recombinação humana envolvidos em mecanismos de reparação relacionados ao estresse de replicação e quebras de DNA em eucariotes. Curiosamente, observou-se que a redução da via HRR melhora a via NHEJ, que é propensa a erros apontando a relevância da via de RH para a estabilidade do genoma8.
O primeiro passo da formação de DSBs é a fosforilação da histona γ-H2AX na Ser-139 por Ataxia telangiectasia mutada quinase (ATM) da família pi3 quinase7,8. Curiosamente, a fosforilação H2AX pode ser visualizada facilmente pela técnica de imunofluorescência como focos (focos γ-H2AX) utilizando anticorpos específicos para H2AX6fosforilado . Há uma relação 1:1 entre o número de DSBs e os focos γ-H2AX, portanto, o marcador DSB, γ-H2AX, é estudado extensivamente através da caracterização da formação de focos, tamanho e quantidade6,,7,,8,,9,,10,,11. A formação de focos γ-H2AX leva ao recrutamento e acúmulo de proteínas de resposta a danos de DNA (DDR) e fatores modificadores de cromatina, como 53BP1 (proteína de ligação p53 1), MDC1 (mediador do ponto de verificação de danos do DNA), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, e muitos outros fatores de reparação formando assim focos induzidos por radiação (RIF). Todas essas proteínas co-localizam com γ-H2AX através de ligação direta ou indireta1,,11,12.
É importante detectar danos de DNA e reparar com um teste sensível adequado, portanto, mais atenção é dada ao desenvolvimento de técnicas altamente precisas13. No contexto de estudos de danos e reparos de DNA, a metodologia é crucial para a detecção sensível de danos no DNA do genoma, descrição da categoria de dano e quantificação de danos de DNA e mecanismos de reparação13. Para detectar células únicas com DNA danificado, o ensaio do cometa é comumente usado em estudos radiobiológicos14. Outros métodos citogenéticos disponíveis reconhecem aberrações cromossômicas, incluindo dicentrics, translocações, fragmentos centrados, anéis e aberrações do tipo cromátide, e danos cromossômicos micronucleos (Mn). O método mais utilizado na radiobiologia, especialmente na dosimetria biológica, é o ensaio do cromossomo dicêntrico devido à sua alta especificidade para radiação15. Por exemplo, o PCR, um método molecular clássico, não pode reconhecer o tipo de dano de DNA detectado. Neste caso, os métodos imunométricos passam o nível de sensibilidade porque as reações são específicas entre o antígeno e o anticorpo. A imagem de imunofluorescência fornece evidências visuais para o aparecimento de diferentes proteínas em focos distintos em resposta a agentes nocivos do DNA como a radiação ionizante16. No entanto, os níveis de ativação dos níveis de mRNA de danos e reparação de proteínas são facilmente detectáveis por PCR em tempo real, que é um método quantitativo adequado para estudos moleculares adicionais no contexto da resposta a danos no DNA17.
Levando em conta que os focos γ-H2AX atraem fatores de reparo18, para monitorar danos e reparos de DNA no nível celular, desenvolvemos um procedimento confiável de coloração de imunofluorescência, baseado na análise dos focos de proteína de reparação representativos da via NHEJ (DNA-PKcs) e Rad52 da via HRR.
Aqui, propomos o uso da imunodetocção para essas proteínas como procedimento eficiente e sensível para o monitoramento da indução e reparação do DNA-DSB. Até agora, não há dados disponíveis sobre DNA-DSBs baseados em focos de proteínas de reparo no nível celular após a irradiação de feixe misto de nêutrons para BNCT, exceto γ-H2AX e 53BP1 marcadores19. Sugerimos a adaptação da linha de células cancerígenas de cólon HCT-116, pois é rica em focos DSBs, como uma linha celular padrão para análise de danos ao DNA, porque os RIFs são facilmente detectáveis. Esta linha celular aderente é fácil de manter e adequada para procedimentos de irradiação. O procedimento proposto baseia-se em uma enorme quantidade de estudos anteriores relacionados ao procedimento geral de imunofluorescência da coloração γ-H2AX. No entanto, inclui todos os detalhes sobre a seleção de anticorpos apropriados com diluições testadas para cada proteína representativa pertencente a cada via de reparo. Além disso, descreve a utilização de um feixe único de nêutrons misturados usado na terapia BNCT. No entanto, recomendamos estender os estudos com ambos os métodos, mancha de imunofluorescência em primeiro lugar e, em seguida, com análise molecular de alto custo, conforme realizado anteriormente4,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
As frequências de focos, imunoquimicamente manchadas para γ-H2AX e 53BP1 são comumente utilizadas em radiobiologia e estão associadas ao número DNA-DSB e são consideradas como marcadores eficientes e sensíveis para monitorar a indução e reparação de DNA-DSBs19. O procedimento de co-coloração de γ-H2AX e 53BP1 é um procedimento padrão para a detecção de DNA-DSBs. A formação de focos γ-H2AX está associada ao recrutamento de 53BP1, um regulador da resposta a danos de DNA<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Feixe misto de nêutrons composto de radiação nêutron/gama foi acessado do reator de pesquisa Maria no Centro Nacional de Pesquisa Nuclear na Polônia. K.M.O. foi apoiado pelo National Science Centre, Poland (Miniatura 2) grant no. #2018/02/X/NZ5/02849.
Materials
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody – ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
References
- Carter, R. J., et al. Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).
- Kondo, N., et al. DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV. Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).
- Sakai, W., Sugasawa, K. DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair. DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , 155-174 (2016).
- Rodriguez, C., et al. In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line. Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).
- Sollazzo, A., et al. Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).
- Jeggo, P., Löbrich, M. Radiation-induced DNA damage responses. Radiation Protection Dosimetry. 122 (1-4), 124-127 (2006).
- Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54. The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).
- Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells. Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX – a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Sage, E., Shikazono, N. Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis. Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).
- Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: immunoassays in DNA damage and instability detection. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).
- Møller, P., et al. Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay. Mutagenesis. , (2020).
- Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).
- Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy. Methods. 48 (1), 63-71 (2009).
- Cheng, L., et al. Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes. PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Okumura, K., et al. Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells. Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).
- Dagrosa, M. A., et al. First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).
- Dagrosa, A., et al. Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer. Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).
- Reynolds, P., et al. The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage. Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).
- Rasche, L., et al. Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study. PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).
- Banáth, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).
- Barth, R. F., et al. Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer. Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).
- Mirzaei, H. R., et al. Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy. Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).
- Vitti, E. T., Parsons, J. L. The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair. Cancers. 11 (7), 946 (2019).
- Mohamad, O., et al. Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair. Cancers. 9 (6), 66 (2017).
