Immunofluorescence הדמיה של נזק לדנ א ותיקון Foci בתאי סרטן המעי הגס האנושי
Summary
המושרה קרינה נזק DNA תגובה המופעלת על ידי מעורב נייטרון קרן המשמש בטיפול בורון נייטרון לכידת (BNCT) לא הוקמה במלואה. פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לזהות וקדי המושרה קרינה (רי ‘ ף) של תיקון חלבונים על ידי immunofluorescence כתמים של סרטן המעי הגס האנושי התאים לאחר הקרנה עם הקורה מעורב נייטרונים.
Abstract
המטרה של כתב היד היא לספק פרוטוקול צעד אחר צעד לביצוע מיקרוסקופ אימונולואוורנסנציה כדי ללמוד את הקרינה המושרה DNA התגובה הנגרמת על ידי נייטרון-גמא מעורב-קרן המשמש לכידת בורון נייטרון (BNCT). באופן ספציפי, המתודולוגיה המוצעת מוחל על איתור חלבונים תיקון הפעלה אשר ניתן לדמיין כמו וקדי באמצעות נוגדנים ספציפיים הפסקות dna כפול סטרנד (dna-dsbs). תיקון DNA וקדי העריכו על ידי immunofluorescence בתאי סרטן המעי הגס (hct-116) לאחר הקרנה עם הקורה מעורב נייטרונים. DNA-DSBs הם נגעים הגנותיים ביותר והם מתוקנים בתאי היונקים על ידי שני מסלולים עיקריים: לא הומוולוגי המעבר מסלול (NHEJ) ותיקון שילוב מחדש הומוולוגי (HRR). התדרים של foci, חיסוני כימית, עבור סמנים בשימוש נפוץ ברדיוביולוגיה כמו γ-H2AX, 53BP1 קשורים עם מספר ה-DNA-DSB נחשבים סמנים יעיל ורגיש עבור ניטור אינדוקציה ותיקון של DNA-Dsb. הוא הוקם כי γ-H2AX וקדי למשוך חלבונים תיקון, המוביל ריכוז גבוה יותר של גורמי תיקון ליד dsb. כדי לנטר נזק לדנ א ברמה התאית, ניתוח immunofluorescence לנוכחות של DNA-PKcs הנציג לתקן חלבון וקדי מהשביל nhej ו Rad52 מהשביל hrr תוכנן. פיתחנו והציג פרוטוקול אמין immunofluorescence כתמים לזיהוי של הקרינה הנגרמת נזק DNA התגובה עם נוגדנים ספציפיים עבור גורמי תיקון משעולים nhej ו hrr ונצפו וקדי המושרה קרינה (ריף). המתודולוגיה המוצעת ניתן להשתמש לחקירת חלבון תיקון כי הוא מופעל מאוד במקרה של קרינה מעורבת-קרן הקורה, ובכך לציין את הדומיננטיות של מסלול התיקון.
Introduction
המושרה קרינה נזק DNA תגובה המופעלת על ידי מעורב נייטרון קרן המשמש בטיפול בורון נייטרון לכידת (BNCT) לא נקבע במלואו. פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לבצע את הזיהוי של וקדי המושרה קרינה (ריף) של תיקון חלבונים על-ידי immunofluorescence מכתים כגון, בתור סרטן המעי הגס האנושי לאחר הקרנה עם הקורה מעורב נייטרונים.
קרינה מייננת (IR) משרה המון סוגים שונים של נזק DNA (DNA-DSBs, DNA-SSBs, בסיס DNA נזק) מתוך איזה הפסקות ה-DNA כפול הגדיל הם נגעים DNA הגנוסיים ביותר1. הפסקות שאינן מתוקנים יכולות לגרום למוות תאים, בעוד שהפסקות מטעות מעלה את ההסתברות לסידור מחדש של כרומוזום, מוטזיס ואובדן מידע גנטי מכריע. התגובה נזק מסלולים להגיב dsbs כוללים מסלולים של תיקון DNA כמו לא הומוולוגי הצטרפות (nhej), מנגנון הדורש Ku 70/80, dna – PKcs, Xrcc4, ו-DNA ליגאז IV כגורמי2מפתח 2,3,4,5,6. ב יונקים, הנתיב השני הראשי תיקון DNA הוא הומוולוגי תיקון שילוב (hrr) מסלול אשר דורש רכיבי מפתח-Rad52 אפיסטזה גן המשפחה – Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 ו-Rad587. Rad51 ו Rad54 הם גורמים מרכזיים שילוב מחדש של האנושי מעורב מנגנוני תיקון הקשורים למתח שכפול והפסקות DNA ב eukaryotes. מעניין, זה היה ציין כי downregulation של מסלול HRR משפר את מסלול NHEJ אשר מועדת שגיאה הצבעה על רלוונטיות מסלול HR עבור יציבות הגנום8.
הצעד הראשון של היווצרות dsbs הוא זרחון של γ-H2AX היסטון ב Ser-139 על ידי אטקסיה telangiectasia מוטציה קינאז (כספומט) ממשפחת PI3 קינאז7,8. מעניין, H2AX זרחון יכול להיות מדמיין בקלות על ידי טכניקת immunofluorescence כמו וקדי (γ-H2AX וקדי) באמצעות נוגדנים ספציפיים עבור זרחליום H2AX6. יש קשר 1:1 בין מספר dsbs ו γ-H2AX וקדי, ולכן, סמן dsbs, γ-H2AX, הוא למד בהרחבה באמצעות האפיון של היווצרות וקדי, גודל, וכמות6,7,8,9,10,11. היווצרות של γ-H2AX וקדי מוביל גיוס והצטברות של תגובה נזק DNA (DDR) חלבונים כרומטין-שינוי גורמים, כגון 53 bp1 (p53 מחייב חלבון 1), MDC1 (מגשר של מחסום נזק DNA), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, parp-1, ורבים אחרים לתקן גורמים ובכך יוצרים וקדי המושרה קרינה (ריף). כל אלה חלבונים שיתוף לוקליזציה עם γ-H2AX באמצעות קשירה ישירה או עקיפה1,11,12.
חשוב לזהות נזק DNA ולתקן עם מבחן רגיש הנכון, ולכן, יותר תשומת לב משולם לפיתוח של טכניקות מדויקות מאוד13. בהקשר של נזק DNA ולימודי תיקון, המתודולוגיה היא חיונית לאיתור רגיש של נזק DNA הגנום, תיאור של הקטגוריה נזק, ו כימות של DNA נזק ותיקון מנגנונים13. כדי לזהות תאים בודדים עם DNA פגום, שיטת השביט משמש בדרך כלל במחקרים רדיוביולוגיה14. שיטות אחרות ציטוגנטיות זמינות לזהות סטיות כרומוזומלית, כולל dicentrics, טרנסמייקומים, שברי האקצנטרי, טבעות, ו כרומאטיד הסוג סטיות, ו מיקרורוקליוס נזק כרומוזום (Mn). השיטה הנפוצה ביותר ברדיוביולוגיה, בעיקר בקרינה ביולוגית, היא שיטת הכרומוזום הדיצנטרי בשל הייחוד הגבוה שלה לקרינהבת 15. לדוגמה, ה-PCR, שיטה מולקולרית קלאסית, אינה יכולה לזהות את סוג הנזק לדנ א שזוהה. במקרה זה, שיטות אימונומטרי לעבור את רמת הרגישות כי התגובות הן ספציפיות בין האנטיגן והנוגדן. הדמיה immunofluorescence מספק ראיות חזותיות למראה של חלבונים שונים בתוך וקדי ברורים בתגובה לסוכנים הפוגעים DNA כמו קרינה מייננת16. עם זאת, רמות ההפעלה של נזק ותיקון חלבונים ‘ רמות mRNA ניתן לגילוי בקלות על ידי PCR בזמן אמת אשר היא שיטה כמותית נאותה למחקרים מולקולריים נוספים בהקשר של נזק DNA תגובה17.
נטילת בחשבון כי γ-H2AX וקדי מושכים לתיקון גורמים18, כדי לפקח על נזק DNA ותיקון ברמה התאית, פיתחנו הליך אמין immunofluorescence מבוסס על הניתוח של הנציג תיקון חלבון וקדי מן המסלול nhej (DNA-PKcs) ו Rad52 מהשביל hrr.
כאן, אנו מציעים את השימוש בזיהוי חיסוני עבור חלבונים אלה כמו הליך יעיל ורגיש עבור ניטור DNA-DSB אינדוקציה ותיקון. עד עכשיו, לא היו נתונים זמינים ב-DNA-dsbs מבוסס על וקדי של תיקון חלבונים ברמה התאית לאחר הקרנה מעורב נייטרון קרן עבור BNCT, למעט γ-H2AX ו-53 bp1 סמנים19. אנו ממליצים על הסתגלות של קו הסרטן HCT-116 המעי הגס, כפי שהוא עשיר עצמו ב-DSBs foci, כמו קו תא סטנדרטי עבור ניתוח DNA נזק, כי RIFs הם לזיהוי בקלות. קו התאים החסיד הזה קל לתחזוקה ולהליך הקרנה. ההליך המוצע מבוסס על כמות עצומה של מחקרים קודמים הקשורים להליך החיסונית הכללית של γ-H2AX כתמים. עם זאת, הוא כולל את כל הפרטים לגבי הבחירה של נוגדנים מתאימים עם מדלל נבדק עבור כל חלבון מייצג שייך לכל מסלול תיקון. כמו-כן, היא מתארת את הניצול של קרן נייטרון מעורבת ייחודית המשמשת בטיפול BNCT. עם זאת, אנו ממליצים להאריך את המחקרים עם שתי השיטות, immunofluorescence כתמים ראשית ולאחר מכן, עם ניתוח מולקולרי בעלות גבוהה כפי שבוצעה בעבר4,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
התדרים של foci, חיסוני מוכתם כימית עבור γ-H2AX ו-53BP1 משמשים בדרך כלל רדיוביולוגיה והם קשורים עם DNA-DSB מספר נחשבים כמו סמנים יעילים ורגישים עבור ניטור אינדוקציה ותיקון של DNA-Dsb19. הליך שיתוף הצביעת של γ-H2AX ו-53bp1 הוא הליך סטנדרטי לזיהוי של DNA-dsbs. היווצרות γ-H2AX וקדי משויך גיוס של 53bp1, מווסת ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נייטרון-קרן מעורבת המורכבת מקרינת נייטרון/גמא הגישה מתוך הכור למחקר מריה במרכז הלאומי למחקר גרעיני בפולין. K.M.O. היה נתמך על ידי המרכז הלאומי למדע, פולין (Miniatura 2) מענק no. #2018/02/X/5/02849.
Materials
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody – ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
References
- Carter, R. J., et al. Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).
- Kondo, N., et al. DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV. Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).
- Sakai, W., Sugasawa, K. DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair. DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , 155-174 (2016).
- Rodriguez, C., et al. In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line. Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).
- Sollazzo, A., et al. Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).
- Jeggo, P., Löbrich, M. Radiation-induced DNA damage responses. Radiation Protection Dosimetry. 122 (1-4), 124-127 (2006).
- Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54. The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).
- Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells. Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX – a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Sage, E., Shikazono, N. Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis. Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).
- Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: immunoassays in DNA damage and instability detection. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).
- Møller, P., et al. Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay. Mutagenesis. , (2020).
- Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).
- Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy. Methods. 48 (1), 63-71 (2009).
- Cheng, L., et al. Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes. PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Okumura, K., et al. Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells. Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).
- Dagrosa, M. A., et al. First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).
- Dagrosa, A., et al. Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer. Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).
- Reynolds, P., et al. The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage. Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).
- Rasche, L., et al. Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study. PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).
- Banáth, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).
- Barth, R. F., et al. Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer. Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).
- Mirzaei, H. R., et al. Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy. Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).
- Vitti, E. T., Parsons, J. L. The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair. Cancers. 11 (7), 946 (2019).
- Mohamad, O., et al. Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair. Cancers. 9 (6), 66 (2017).
