Иммунофлуоресценция Визуализация повреждения ДНК и ремонт Фочи в раковых клетках толстой кишки человека
Summary
Радиационно-индуцированная реакция повреждения ДНК активируется нейтронной смешанной балки, используемой в бор нейтронной терапии захвата (BNCT) не была полностью установлена. Этот протокол обеспечивает пошаговую процедуру для обнаружения радиационно-индуцированных очагов (РИФ) ремонтных белков путем окрашивания иммунофлуоресценции в линиях раковых клеток толстой кишки человека после облучения нейтронно-смешанным лучом.
Abstract
Целью рукописи является предоставление пошагового протокола для выполнения иммунофлуоресценции микроскопии для изучения радиационно-индуцированного реакции повреждения ДНК, вызванного нейтронно-гамма-смешанным лучом, используемым в терапии захвата боров нейтронов (BNCT). В частности, предлагаемая методология применяется для обнаружения активации ремонтных белков, которые могут быть визуализированы как очаги с использованием антител, характерных для ДНК двойных разрывов (ДНК-DSBs). Очаги репарации ДНК были оценены иммунофлуоресценцией в раковых клетках толстой кишки (HCT-116) после облучения нейтронно-смешанным лучом. ДНК-DSBs являются наиболее генотоксических поражений и восстанавливаются в клетках млекопитающих двумя основными путями: нехомологичные пути конечного присоединения (NHEJ) и гомологичные ремонт рекомбинации (HRR). Частоты очагов, иммунохимически окрашенных, для широко используемых маркеров в радиобиологии, как q-H2AX, 53BP1 связаны с ДНК-DSB число и считаются эффективными и чувствительными маркерами для мониторинга индукции и ремонта ДНК-DSBs. Было установлено, что фочи q-H2AX привлекают ремонтные белки, что приводит к более высокой концентрации факторов ремонта вблизи DSB. Для мониторинга повреждения ДНК на клеточном уровне был запланирован иммунофлуоресценциотический анализ на наличие репрезентативного протеинового очага ДНК-ПКК от пути NHEJ и Rad52 от пути HRR. Мы разработали и внедрили надежный протокол окрашивания иммунофлуоресценции для обнаружения радиационно-индуцированного реакции повреждения ДНК с антителами, специфическими для ремонтных факторов от NHEJ и HRR путей и наблюдаемых радиационно-индуцированных очагов (RIF). Предлагаемая методология может быть использована для исследования ремонта белка, который высоко активирован в случае нейтронно-смешанного луча излучения, тем самым указывая на доминирование пути ремонта.
Introduction
Радиационно-индуцированная реакция повреждения ДНК активируется нейтронным смешанным лучом, используемым в терапии захвата бора нейтронов (BNCT), не была полностью определена. Этот протокол обеспечивает пошаговую процедуру для выполнения обнаружения радиационно-индуцированных очагов (РИФ) ремонтных белков путем окрашивания иммунофлуоресценции, например, в линии рака толстой кишки человека после облучения нейтронно-смешанным лучом.
Ионизирующее излучение (ИО) вызывает множество различных типов повреждений ДНК (ДНК-ДСБ, ДНК-SSBs, повреждение основания ДНК), из которых ДНК двойных разрывов являются наиболее генотоксических поражений ДНК1. Неремонтированные разрывы могут привести к гибели клеток, в то время как неправильное расстройство повышает вероятность перестановки в хромосоме, мутагенеза и потери решающей генетической информации. Пути реагирования на повреждения, реагирующие на DSBs, включают пути репарации ДНК, такие как нехомологичное присоединение к концу (NHEJ), механизм, который требует Ku 70/80, ДНК-PKcs, Xrcc4 и ДНК-лигаза IV в качестве ключевых факторов2,3,4,5,6. У млекопитающих, второй основной путь репарации ДНК гомологии рекомбинации ремонта (HRR) путь, который требует ключевых компонентов – Rad52 эпистаз гена семьи Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 и Rad587. Rad51 и Rad54 являются ключевыми факторами рекомбинации человека, участвующими в механизмах восстановления, связанных со стрессом репликации и разрывами ДНК в эукариотах. Интересно, было отмечено, что downregulation пути HRR повышает ПУТЬ NHEJ, который является подверженным ошибкам указывая на HR пути актуальность для стабильности генома8.
Первым шагом формирования DSBs является фосфорилирование гистона q-H2AX в Сер-139 от Ataxia telangiectasia мутировавших киназы (ATM) из семейства PI3киназы 7,8. Интересно, что фосфорилирование H2AX можно легко визуализировать с помощью иммунофлуоресценции, как foci (К-H2AX foci) с использованием антител, специфических для фосфорилированного H2AX6. Существует 1:1 связь между числом DSBs и Q-H2AX foci, поэтому, DSB маркер, q-H2AX, изучается широко через характеристику формирования очагов, размер, и количество6,7,8,9,10,11.7 Формирование очагов q-H2AX приводит к набору и накоплению белков реакции на повреждение ДНК (DDR) и хроматин-модифицирующих факторов, таких как 53BP1 (p53 связывающий белок 1), MDC1 (посредник контрольно-пропускного пункта повреждения ДНК), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1 и многие другие ремонтные факторы, таким образом, образуя радиацию. Все эти белки совместно локализуются с помощью q-H2AX через прямую или косвенную привязку1,,11,12.
Важно обнаружить повреждение ДНК и восстановить с помощью правильного чувствительного теста, поэтому больше внимания уделяется разработке высокоточных методов13. В контексте повреждения ДНК и ремонтных исследований, методология имеет решающее значение для чувствительного обнаружения повреждения ДНК генома, описание категории повреждений, а также количественное повреждение ДНК и механизмы ремонта13. Для обнаружения одиночных клеток с поврежденной ДНК, комета анализ обычно используется в радиобиологических исследованиях14. Другие доступные цитогенетические методы распознают хромосомные аберрации, включая дицентрические, транслокации, ацентрические фрагменты, кольца и аберрации хроматированного типа и хромосомные повреждения микронуклеуса (Mn). Наиболее часто используемым методом в радиобиологии, особенно в биологической дозиметрии, является дицентрический анализ хромосомы из-за его высокой специфичности для излучения15. Например, ПЦР, классический молекулярный метод, не может распознать тип обнаруженного повреждения ДНК. В этом случае иммунометрические методы проходят уровень чувствительности, потому что реакции специфичны между антигеном и антителом. Иммунофлуоресценция изображений обеспечивает визуальные доказательства появления различных белков в различных очагов в ответ на ДНК повреждения агентов, как ионизирующее излучение16. Тем не менее, уровни активации повреждения и восстановления белков мРНК уровни легко обнаруживаются в режиме реального времени ПЦР, который является надлежащим количественным методом для дальнейших молекулярных исследований в контексте реакции повреждения ДНК17.
Принимая во внимание, что foci q-H2AX привлекает факторы ремонта18, для мониторинга повреждения ДНК и ремонта на клеточном уровне, мы разработали надежную процедуру окрашивания иммунофлуоресценции, основанную на анализе репрезентативного ремонта белковых очагов из NHL pathway (DNA-PKcs) и Rad52 от пути HRR.
Здесь мы предлагаем использовать иммунодефицит для этих белков в качестве эффективной и чувствительной процедуры для мониторинга индукции дНК-DSB и ремонта. До сих пор не было доступных данных о ДНК-DSBs на основе очагов ремонтных белков на клеточном уровне после нейтронного смешанного луча облучения для БНКТ, за исключением маркеров З-H2AX и 53BP119. Мы предлагаем адаптацию линии раковых клеток толстой кишки HCT-116, так как она богата в DSBs foci, как стандартная линия клеток для анализа повреждений ДНК, потому что РИФ легко обнаруживаются. Эта линия адепта клетки проста в обслуживании и надлежащим для процедур облучения. Предлагаемая процедура основана на огромном количестве предыдущих исследований, связанных с общей процедурой иммунофлуоресценции окрашивания в З-H2AX. Тем не менее, он включает в себя все детали, касающиеся выбора соответствующих антител с проверенными разбавлениями для каждого репрезентативного белка, принадлежащего к каждому пути ремонта. Кроме того, он описывает использование уникального нейтронно-смешанного луча, используемого в терапии БНКТ. Тем не менее, мы рекомендуем расширить исследования с обоих методов, иммунофлуоресценции окрашивания во-первых, а затем, с высокой стоимости молекулярного анализа, как это было выполнено ранее4,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Частоты очагов, иммунохимически окрашенных для q-H2AX и 53BP1 широко используются в радиобиологии и связаны с ДНК-DSB число и считаются эффективными и чувствительными маркерами для мониторинга индукции и ремонта ДНК-DSBs19. Процедура совместного окрашивания q-H2AX и 53BP1 является стан?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Нейтронно-смешанный луч, состоящий из нейтронного/гамма-излучения, был получен из исследовательского реактора Марии в Национальном центре ядерных исследований в Польше. K.M.O. была поддержана Национальным научным центром, Польша (Miniatura 2) грант No #2018/02/X/N’5/02849.
Materials
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody – ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
References
- Carter, R. J., et al. Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).
- Kondo, N., et al. DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV. Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).
- Sakai, W., Sugasawa, K. DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair. DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , 155-174 (2016).
- Rodriguez, C., et al. In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line. Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).
- Sollazzo, A., et al. Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).
- Jeggo, P., Löbrich, M. Radiation-induced DNA damage responses. Radiation Protection Dosimetry. 122 (1-4), 124-127 (2006).
- Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54. The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).
- Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells. Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX – a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Sage, E., Shikazono, N. Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis. Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).
- Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: immunoassays in DNA damage and instability detection. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).
- Møller, P., et al. Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay. Mutagenesis. , (2020).
- Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).
- Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy. Methods. 48 (1), 63-71 (2009).
- Cheng, L., et al. Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes. PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Okumura, K., et al. Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells. Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).
- Dagrosa, M. A., et al. First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).
- Dagrosa, A., et al. Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer. Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).
- Reynolds, P., et al. The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage. Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).
- Rasche, L., et al. Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study. PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).
- Banáth, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).
- Barth, R. F., et al. Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer. Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).
- Mirzaei, H. R., et al. Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy. Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).
- Vitti, E. T., Parsons, J. L. The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair. Cancers. 11 (7), 946 (2019).
- Mohamad, O., et al. Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair. Cancers. 9 (6), 66 (2017).
