Immunofluorescenza Immagini di danno al DNA e riparazione Foci nelle cellule tumorali del colon umano
Summary
La risposta al danno del DNA indotta dalle radiazioni attivata dal fascio misto di neutroni utilizzato nella terapia di cattura di neutroni boronica (BNCT) non è stata completamente stabilita. Questo protocollo fornisce una procedura graduale per rilevare i foci indotti da radiazioni (RIF) delle proteine di riparazione mediante colorazione immunofluorescenza nelle linee cellulari del cancro del colon umano dopo l’irradiazione con il fascio di neutroni misto.
Abstract
Lo scopo del manoscritto è quello di fornire un protocollo graduale per l’esecuzione della microscopia immunofluorescenza per studiare la risposta al danno del DNA indotta dalle radiazioni indotta dal fascio misto neutro-gamma utilizzato nella terapia di cattura di neutroni boro (BNCT). In particolare, la metodologia proposta viene applicata per il rilevamento dell’attivazione delle proteine di riparazione che può essere visualizzata come foci utilizzando anticorpi specifici per le rotture del DNA a doppio filamento (DNA-DSB). I foci di riparazione del DNA sono stati valutati dall’immunofluorescenza nelle cellule tumorali del colon (HCT-116) dopo l’irradiazione con il fascio misto di neutroni. I DNA-DSB sono le lesioni più genotosine e vengono riparate nelle cellule dei mammiferi da due vie principali: la via di giunzione finale non omologa (NHEJ) e la riparazione omologa ricombinazione (HRR). Le frequenze dei foci, macchiati immunochimicamente, per i marcatori comunemente usati in radiobiologia come l’H2AX, 53BP1 sono associati al numero DNA-DSB e sono considerati marcatori efficienti e sensibili per monitorare l’induzione e la riparazione di DNA-DSB. È stato stabilito che i foci-H2AX attraggono le proteine di riparazione, portando ad una maggiore concentrazione di fattori di riparazione nei pressi di un DSB. Per monitorare i danni al DNA a livello cellulare, è stata pianificata un’analisi dell’immunofluorescenza per la presenza di focolai proteici di riparazione di riparazione DNA-PKcs rappresentativi dalla via NHEJ e Rad52 dal percorso HRR. Abbiamo sviluppato e introdotto un protocollo affidabile di colorazione dell’immunofluorescenza per il rilevamento della risposta al danno del DNA indotta da radiazioni con anticorpi specifici per i fattori di riparazione delle vie NHEJ e HRR e foci indotti da radiazioni (RIF) indotti da radiazioni. La metodologia proposta può essere utilizzata per studiare proteine di riparazione altamente attivate nel caso di radiazioni a fascio miscelato di neutroni, indicando così il predominio del percorso di riparazione.
Introduction
La risposta al danno del DNA indotta dalle radiazioni attivata dal fascio misto di neutroni utilizzato nella terapia di cattura di neutroni boronica (BNCT) non è stata completamente determinata. Questo protocollo fornisce una procedura passo-passo per eseguire il rilevamento di foci indotti da radiazioni (RIF) di proteine di riparazione mediante colorazione immunofluorescenza, ad esempio, nella linea cellulare umana dopo l’irradiazione con il fascio di neutroni misto.
Le radiazioni ionizzanti (IR) inducono una moltitudine di diversi tipi di danno al DNA (DNA-DSB, DNA-SSB, danni alla base del DNA) da cui le rotture del DNA a doppio filamento sono le lesioni del DNA più genotossiche1. Le rotture non riparate possono causare la morte delle cellule, mentre le rotture errate aumentano la probabilità di riarrangiamento cromosomico, mutagenesi e perdita di informazioni genetiche decisive. I percorsi di risposta ai danni che rispondono ai DSB includono vie di riparazione del DNA come l’unione finale non omologa (NHEJ), un meccanismo che richiede Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4, e DNA ligase IV come fattori chiave2,3,4,5,6. Nei mammiferi, la seconda via principale di riparazione del DNA è la via omologa di riparazione della ricombinazione (HRR) che richiede componenti chiave – la famiglia genica Rad52 epistasis – Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 e Rad587. Rad51 e Rad54 sono fattori chiave di ricombinazione umana coinvolti nei meccanismi di riparazione legati allo stress da replicazione e alle rotture del DNA negli eucarioti. È interessante notare che è stato osservato che la downregolazione del percorso HRR migliora la via NHEJ che è soggetta a errori indicando la pertinenza del percorso HR per la stabilità del genoma8.
Il primo passo della formazione dei DSB è la fosforolalazione dell’istone di z-H2AX a Ser-139 dell’Ataxia telangiectasia mutata chinasi (ATM) della famiglia pi3 chinasi7,8. È interessante notare che il fosfororylazione H2AX può essere facilmente visualizzata con la tecnica dell’immunofluorescenza come foci (z-H2AX foci) utilizzando anticorpi specifici per il fosforoH6. C’è una relazione 1:1 tra il numero di DSB e i foci di z-H2AX, quindi, il marcatore DSB, z-H2AX, è studiato ampiamente attraverso la caratterizzazione della formazione di foci, delle dimensioni e della quantità6,7,8,9,10,11.11 La formazione di foci di z-H2AX porta al reclutamento e all’accumulo di proteine d’emergenza (DDR) e fattori che modificano la cromatina, come 53BP1 (proteina legante p53 1), MDC1 (mediatore del checkpoint del danno al DNA), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1 e molti altri fattori di riparazione che formano così i fattori di riparazione indotti da radiazioni (RIF). Tutte queste proteine co-localizzano con la z-H2AX attraverso il legame diretto o indiretto1,11,12.
È importante rilevare i danni al DNA e riparare con un adeguato test sensibile, quindi, più attenzione è prestata allo sviluppo di tecniche altamente precise13. Nel contesto degli studi di riparazione e danni al DNA, la metodologia è fondamentale per il rilevamento sensibile del danno del DNA del genoma, la descrizione della categoria di danni e la quantificazione del danno del DNA e dei meccanismi di riparazione13. Per rilevare singole cellule con DNA danneggiato, il saggio della cometa viene utilizzato comunemente negli studi radiobiologici14. Altri metodi citogenetici disponibili riconoscono le aberrazioni cromosomiche, tra cui dicentrici, traslocazioni, frammenti acentrici, anelli e aberrazioni di tipo cromata, e danni cromosomici micronucleosi (Mn). Il metodo più frequentemente usato nella radiobiologia, specialmente nella dosimetria biologica, è il saggio cromosomico dicentrico dovuto alla sua elevata specificità per la radiazione15. Ad esempio, la PCR, un metodo molecolare classico, non è in grado di riconoscere il tipo di danno rilevato al DNA. In questo caso, i metodi immunometrici passano il livello di sensibilità perché le reazioni sono specifiche tra l’antigene e l’anticorpo. L’imaging dell’immunofluorescenza fornisce prove visive per la comparsa di diverse proteine in focolai distinti in risposta ad agenti dannosi del DNA come le radiazioni ionizzanti16. Tuttavia, i livelli di attivazione dei danni e dei livelli di mRNA delle proteine di riparazione sono facilmente rilevabili dalla PCR in tempo reale, il cui metodo quantitativo è un metodo quantitativo adeguato per ulteriori studi molecolari nel contesto della risposta al danno del DNA17.
Tenendo conto che i foci-H2AX attirano i fattori di riparazione18, per monitorare i danni al DNA e la riparazione a livello cellulare, abbiamo sviluppato una procedura affidabile di colorazione immunofluorescenza, basata sull’analisi dei focolai proteici di riparazione rappresentativi dal percorso NHEJ (DNA-PKcs) e Rad52 dal percorso HRR.
Qui, proponiamo l’uso dell’immunodiagnosi per queste proteine come procedura efficiente e sensibile per il monitoraggio dell’induzione e della riparazione del DNA-DSB. Fino ad ora, non ci sono stati dati disponibili sul DNA-DSB a base di foci di proteine di riparazione a livello cellulare dopo l’irradiazione a fascio misto di neutroni per BNCT, ad eccezione dei marcatori di -H2AX e 53BP119. Suggeriamo l’adattamento della linea cellulare del cancro del colon HCT-116, in quanto è ricca di DSBs foci, come linea cellulare standard per l’analisi dei danni al DNA, perché i RIF sono facilmente rilevabili. Questa linea cellulare aderente è facile da mantenere e corretta per le procedure di irradiazione. La procedura proposta si basa su un’enorme quantità di studi precedenti relativi alla procedura generale di immunofluorescenza della colorazione z-H2AX. Tuttavia, include tutti i dettagli relativi alla selezione di anticorpi appropriati con diluizioni testate per ogni proteina rappresentativa appartenente a ciascun percorso di riparazione. Inoltre, descrive l’utilizzo di un fascio unico miscelato a neutroni utilizzato nella terapia BNCT. Tuttavia, si consiglia di estendere gli studi con entrambi i metodi, l’immunofluorescenza colorazione prima e poi, con l’analisi molecolare ad alto costo come eseguito in precedenza4,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le frequenze dei foci, immunochimicamente macchiati per la z-H2AX e 53BP1 sono comunemente utilizzate nella radiobiologia e sono associate al numero DNA-DSB e sono considerate come marcatori efficienti e sensibili per monitorare l’induzione e la riparazione di DNA-DSB19. La procedura di co-colorazione di -H2AX e 53BP1 è una procedura standard per la rilevazione di DNA-DSBs. La formazione dei focolai di H2AX è associata al reclutamento di 53BP1, regolatore della risposta al danno del DNA<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il fascio misto di neutroni composto da radiazioni neutroni/gamma è stato consultato dal reattore di ricerca Maria del Centro nazionale per la ricerca nucleare in Polonia. K.M.O. è stato sostenuto dal National Science Centre, Polonia (Miniatura 2) sovvenzione n. #2018/02/X/N’5/02849.
Materials
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody – ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
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