Imágenes de inmunofluorescencia de daños en el ADN y dosis de focos en células de cáncer de colon humano
Summary
No se ha establecido completamente la respuesta de daño del ADN inducida por radiación activada por el haz mixto de neutrones utilizado en la terapia de captura de neutrones de boro (BNCT). Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para detectar focos inducidos por radiación (RIF) de proteínas de reparación mediante tinción de inmunofluorescencia en líneas celulares de cáncer de colon humano después de la irradiación con el haz mezclado con neutrones.
Abstract
El propósito del manuscrito es proporcionar un protocolo paso a paso para realizar microscopía de inmunofluorescencia para estudiar la respuesta de daño de ADN inducida por radiación inducida por el haz mixto de neutrones-gamma utilizado en la terapia de captura de neutrones de boro (BNCT). Específicamente, la metodología propuesta se aplica para la detección de la activación de proteínas de reparación que se pueden visualizar como focos utilizando anticuerpos específicos para roturas de doble cadena de ADN (ADN-DSB). Los focos de reparación del ADN fueron evaluados por inmunofluorescencia en células de cáncer de colon (HCT-116) después de la irradiación con el haz mezclado con neutrones. Los ADN-DSB son las lesiones más genotóxicas y se reparan en células de mamíferos por dos vías principales: vía de unión final no homóloga (NHEJ) y reparación de recombinación homóloga (HRR). Las frecuencias de los focos, inmunoquímicamente manchadas, para los marcadores de uso común en radiobiología como el H2AX, 53BP1 están asociadas con el número DNA-DSB y se consideran marcadores eficientes y sensibles para monitorear la inducción y reparación de ADN-DSB. Se estableció que los focos de la serie H2AX atraen proteínas de reparación, lo que llevó a una mayor concentración de factores de reparación cerca de un OSD. Para monitorear el daño del ADN a nivel celular, se planeó un análisis de inmunofluorescencia para la presencia de focos de proteína de reparación representativos de ADN-PKcs de la vía NHEJ y Rad52 de la vía HRR. Hemos desarrollado e introducido un protocolo de tinción de inmunofluorescencia fiable para la detección de la respuesta de daño del ADN inducida por radiación con anticuerpos específicos para factores de reparación de las vías NHEJ y HRR y focos observados por radiación (RIF). La metodología propuesta se puede utilizar para investigar la proteína de reparación que está altamente activada en el caso de la radiación de haz mezclado con neutrones, lo que indica el dominio de la vía de reparación.
Introduction
No se ha determinado completamente la respuesta al daño del ADN inducida por radiación activada por el haz mixto de neutrones utilizado en la terapia de captura de neutrones de boro (BNCT). Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para realizar la detección de focos inducidos por radiación (RIF) de proteínas de reparación mediante tinción de inmunofluorescencia, por ejemplo, en la línea celular del cáncer de colon humano después de la irradiación con el haz mezclado con neutrones.
La radiación ionizante (IR) induce una multitud de tipos diferentes de daño del ADN (ADN-DSB, DNA-SSB, daño a la base de ADN) de los cuales las roturas de doble cadena de ADN son las lesiones de ADN más genotóxicas1. Las roturas no reparadas pueden causar la muerte celular, mientras que las roturas mal reparadas aumentan la probabilidad de reordenamiento cromosómica, mutagénesis y pérdida de información genética decisiva. Las vías de respuesta al daño que responden a los DSB incluyen vías de reparación del ADN como la unión final no homóloga (NHEJ), un mecanismo que requiere Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4, y DNA ligasse IV como factores clave2,,3,4,5,6. En los mamíferos, la segunda vía principal de reparación del ADN es la vía de reparación de recombinación homóloga (HRR) que requiere componentes clave – la familia del gen de la epistasis Rad52 – Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 y Rad587. Rad51 y Rad54 son factores clave de recombinación humana implicados en mecanismos de reparación relacionados con el estrés de replicación y roturas de ADN en eucariotas. Curiosamente, se observó que la regulación descendente de la vía HRR mejora la vía NHEJ que es propensa a errores apuntando a la relevancia de la vía de RRHH para la estabilidad del genoma8.
El primer paso de la formación de los DSB es la fosforilación de la histona de la serie H2AX en ser-139 por Ataxia telangiectasia mutated kinase (ATM) de la familia PI3 quinasa7,8. Curiosamente, la fosforilación H2AX se puede visualizar fácilmente mediante la técnica de inmunofluorescencia como focos (focis de H2AX) utilizando anticuerpos específicos para H2AX6fosforilado. Existe una relación de 1:1 entre el número de DSB y los focos de H2AX, por lo tanto, el marcador DSB, -H2AX, se estudia extensamente a través de la caracterización de la formación de focos, tamaño, y cantidad6,7,8,9,10,11. La formación de focos de la serie H2AX conduce al reclutamiento y acumulación de proteínas de respuesta al daño del ADN (DDR) y factores modificadores de la cromatina, tales como 53BP1 (proteína de unión p53 1), MDC1 (mediador del punto de control de daño del ADN), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, y muchos otros factores de reparación formando así factores de radiación inducidas por la radiación (RIF). Todas estas proteínas se co-localizan con el valor de H2AX a través de la unión directa o indirecta1,11,12.
Es importante detectar el daño y la reparación del ADN con una prueba sensible adecuada, por lo tanto, se presta más atención al desarrollo de técnicas de alta precisión13. En el contexto de los estudios de daño y reparación del ADN, la metodología es crucial para la detección sensible del daño del ADN genómico, la descripción de la categoría de daño y la cuantificación de los mecanismos de daño y reparación del ADN13. Para detectar células individuales con ADN dañado, el ensayo de cometas se utiliza comúnmente en estudios radiobiológicos14. Otros métodos citogenéticos disponibles reconocen aberraciones cromosómicas, incluyendo dicéntricos, translocaciones, fragmentos alcéricos, anillos y aberraciones de tipo cromático, y daño cromosómico micronúcleo (Mn). El método más utilizado en radiobiología, especialmente en la dosimetría biológica, es el ensayo cromosómica dicéntrica debido a su alta especificidad para la radiación15. Por ejemplo, la PCR, un método molecular clásico, no puede reconocer el tipo de daño de ADN detectado. En este caso, los métodos inmunométricos pasan el nivel de sensibilidad porque las reacciones son específicas entre el antígeno y el anticuerpo. Las imágenes de inmunofluorescencia proporcionan evidencia visual para la aparición de diferentes proteínas en focos distintos en respuesta a agentes dañinos del ADN como la radiación ionizante16. Sin embargo, los niveles de activación del daño y los niveles de ARNm de las proteínas de reparación son fácilmente detectables por PCR en tiempo real, que es un método cuantitativo adecuado para estudios moleculares posteriores en el contexto de la respuesta al daño del ADN17.
Teniendo en cuenta que los focos de H2AX atraen los factores de reparación18, para monitorear el daño y la reparación del ADN a nivel celular, hemos desarrollado un procedimiento de tinción de inmunofluorescencia fiable, basado en el análisis de la reparación representativa de focis proteicos de la vía NHEJ (DNA-PKcs) y Rad52 de la vía HRR.
Aquí, proponemos el uso de inmunodetección para estas proteínas como el procedimiento eficiente y sensible para el seguimiento de la inducción y reparación del ADN-DSB. Hasta ahora, no ha habido datos disponibles sobre ADN-DSB basados en focos de proteínas de reparación a nivel celular después de la irradiación de19haz mixto de neutrones para BNCT, excepto los marcadores de 53BP1 y H2AX y 53BP1. Sugerimos la adaptación de la línea celular de cáncer de colon HCT-116, ya que es rica en focos DSB, como una línea celular estándar para el análisis de daños en el ADN, porque los RF son fácilmente detectables. Esta línea celular adherente es fácil de mantener y adecuada para los procedimientos de irradiación. El procedimiento propuesto se basa en una gran cantidad de estudios previos relacionados con el procedimiento general de inmunofluorescencia de la tinción de H2AX. Sin embargo, incluye todos los detalles relativos a la selección de anticuerpos apropiados con diluciones probadas para cada proteína representativa perteneciente a cada vía de reparación. Además, describe la utilización de un haz único mezclado con neutrones utilizado en la terapia BNCT. Sin embargo, recomendamos ampliar los estudios con ambos métodos, la tinción de inmunofluorescencia en primer lugar y luego, con análisis moleculares de alto costo como se realizó anteriormente4,,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las frecuencias de los focos, teñidas inmunoquímicamente para los puntos de venta de las normas H2AX y 53BP1 se utilizan comúnmente en radiobiología y se asocian con el número DNA-DSB y se consideran marcadores eficientes y sensibles para supervisar la inducción y reparación de los ADN-DSB19. El procedimiento de co-tinción de los puntos de vista de los datos de la serie de residuos de H2AX y 53BP1 es un procedimiento estándar para la detección de ADN-DSB. La formación de los focos de H2…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Desde el reactor de investigación Maria del Centro Nacional de Investigación Nuclear en Polonia se accedió al haz mixto de neutrones compuesto por radiación de neutrones/gamma. K.M.O. recibió el apoyo del Centro Nacional de Ciencias, Polonia (Miniatura 2) no #2018/02/X/NZ5/02849.
Materials
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody – ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
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