Imagerie d’immunofluorescence des dommages d’ADN et des foyers de réparation dans les cellules cancéreuses du côlon humain
Summary
La réponse aux dommages causés par l’ADN par rayonnement activé par le faisceau mixte de neutrons utilisé dans la thérapie de capture de neutrons de bore (BNCT) n’a pas été entièrement établie. Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour détecter les foyers induits par rayonnement (RIF) des protéines de réparation par la coloration d’immunofluorescence dans les lignées cellulaires du cancer du côlon humain après irradiation avec le faisceau mélangé à neutrons.
Abstract
Le but du manuscrit est de fournir un protocole étape par étape pour l’exécution de la microscopie d’immunofluorescence pour étudier la réponse de dommages causés par l’ADN induit par le rayonnement induit par neutron-gamma faisceau mixte utilisé dans la thérapie de capture de neutrons de bore (BNCT). Plus précisément, la méthodologie proposée est appliquée pour la détection de l’activation des protéines de réparation qui peuvent être visualisées comme des foyers à l’aide d’anticorps spécifiques aux ruptures à double brin d’ADN (ADN-DSB). Les foyers de réparation d’ADN ont été évalués par immunofluorescence dans les cellules cancéreuses du côlon (HCT-116) après irradiation avec le faisceau neutronique. Les ADN-DSB sont les lésions les plus génotoxiques et sont réparées dans les cellules de mammifères par deux voies principales : la voie de jointure des terminaisons non homologues (NHEJ) et la réparation de recombinaison homologue (HRR). Les fréquences des foyers, tachés immunochimiquement, pour les marqueurs couramment utilisés en radiobiologie comme γ-H2AX, 53BP1 sont associées au numéro DNA-DSB et sont considérées comme des marqueurs efficaces et sensibles pour surveiller l’induction et la réparation des ADN-DSB. Il a été établi que les foyers γ-H2AX attirent les protéines de réparation, ce qui entraîne une concentration plus élevée de facteurs de réparation près d’un DSB. Pour surveiller les dommages causés par l’ADN au niveau cellulaire, l’analyse de l’immunofluorescence pour la présence de foyers protéiques de réparation représentatifs de l’ADN-PKcs provenant de la voie NHEJ et de Rad52 de la voie HRR a été prévue. Nous avons développé et introduit un protocole fiable de coloration d’immunofluorescence pour la détection de la réponse de dommages d’ADN induite par le rayonnement avec des anticorps spécifiques aux facteurs de réparation des voies de NHEJ et de HRR et des foyers induits par rayonnement (RIF). La méthodologie proposée peut être utilisée pour étudier les protéines de réparation qui sont fortement activées dans le cas du rayonnement de faisceau de neutrons-mélangé, indiquant ainsi la dominance de la voie de réparation.
Introduction
La réponse aux dommages causés par rayonnement de dommages d’ADN activé par le faisceau mixte de neutrons employé dans la thérapie de capture de neutron de bore (BNCT) n’a pas été entièrement déterminée. Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour effectuer la détection des foyers induits par rayonnement (RIF) des protéines de réparation par la coloration d’immunofluorescence par exemple, dans la lignée cellulaire du côlon humain après irradiation avec le faisceau mélangé à neutrons.
Le rayonnement ionisant (IR) induit une multitude de différents types de dommages à l’ADN (ADN-DSB, ADN-SSBs, dommages de base d’ADN) dont les ruptures de double brin d’ADN sont les lésions d’ADN les plus génotoxiques1. Les ruptures non réparées peuvent causer la mort cellulaire, tandis que les ruptures mal réparées augmentent la probabilité de réarrangement chromosomique, de mutagénèse et de perte d’informations génétiques décisives. Les voies de réponse aux dommages répondant aux DSB comprennent des voies de réparation de l’ADN comme l’assemblage final non homologue (NHEJ), un mécanisme qui nécessite Ku 70/80, ADN–PKcs, Xrcc4, et ligase IV d’ADN comme facteurs clés2,3,4,5,6. Chez les mammifères, la deuxième voie principale de réparation de l’ADN est la voie de réparation de recombinaison homologue (HRR) qui nécessite des composants clés – la famille de gènes d’épistase Rad52 – Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 et Rad587. Rad51 et Rad54 sont des facteurs clés de recombinaison humaine impliqués dans les mécanismes de réparation liés au stress de réplication et aux ruptures d’ADN dans les eucaryotes. Fait intéressant, il a été observé que la downregulation de la voie HRR améliore la voie NHEJ qui est sujette aux erreurs pointant vers la pertinence de la voie RH pour la stabilité du génome8.
La première étape de la formation de DSBs est la phosphorylation de l’histone γ-H2AX à Ser-139 par Ataxia telangiectasia muté kinase (ATM) de la famille PI3 kinase7,8. Fait intéressant, la phosphorylation H2AX peut être visualisée facilement par la technique d’immunofluorescence comme foyers (γ-H2AX foyers) à l’aide d’anticorps spécifiques pour le H2AX6phosphorylé. Il ya une relation 1:1 entre le nombre de DSBs et γ-H2AX foyers, par conséquent, marqueur DSB, γ-H2AX, est étudié en profondeur par la caractérisation de la formation de foyers, la taille, et la quantité6,7,8,9,10,11. La formation de foyers γ-H2AX conduit au recrutement et à l’accumulation de protéines de réponse aux dommages à l’ADN (DDR) et de facteurs modificateurs de la chromatine, tels que 53BP1 (protéine liante p53 1), MDC1 (médiateur du point de contrôle des dommages causés par l’ADN), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, et bien d’autres facteurs de réparation formant ainsi des foyers induits par les radiations (RIF). Toutes ces protéines co-localisent avec γ-H2AX par liaison directe ou indirecte1,11,12.
Il est important de détecter les dommages à l’ADN et de réparer avec un test sensible approprié, par conséquent, plus d’attention est accordée au développement de techniques très précises13. Dans le contexte des études sur les dommages à l’ADN et les réparations, la méthodologie est cruciale pour la détection sensible des dommages causés par l’ADN du génome, la description de la catégorie des dommages et la quantification des dommages à l’ADN et les mécanismes de réparation13. Pour détecter les cellules individuelles avec l’ADN endommagé, l’essai de comète est couramment utilisé dans les études radiobiologiques14. D’autres méthodes cytogénétiques disponibles reconnaissent les aberrations chromosomiques, y compris les dicentriques, les translocations, les fragments acentriques, les anneaux et les aberrations de type chromatid, et les dommages chromosomiques de micronucléus (Mn). La méthode la plus fréquemment utilisée en radiobiologie, en particulier dans la dosimétrie biologique, est l’essai chromosomique dicentrique en raison de sa grande spécificité pour le rayonnement15. Par exemple, pcr, une méthode moléculaire classique, ne peut pas reconnaître le type de dommages détectés à l’ADN. Dans ce cas, les méthodes immunométriques passent le niveau de sensibilité parce que les réactions sont spécifiques entre l’antigène et l’anticorps. L’imagerie par immunofluorescence fournit des preuves visuelles de l’apparition de différentes protéines dans des foyers distincts en réponse à des agents nuisibles à l’ADN comme le rayonnement ionisant16. Cependant, les niveaux d’activation des dommages et les niveaux d’ARNm des protéines de réparation sont facilement détectables par PCR en temps réel qui est une méthode quantitative appropriée pour d’autres études moléculaires dans le contexte de la réponse de dommages d’ADN17.
Compte tenu du fait que les foyers γ-H2AX attirent les facteurs de réparation18, pour surveiller les dommages à l’ADN et réparer au niveau cellulaire, nous avons développé une procédure fiable de coloration d’immunofluorescence, basée sur l’analyse des foyers de protéine de réparation représentatifs de la voie NHEJ (ADN-PKcs) et Rad52 de la voie HRR.
Ici, nous proposons l’utilisation de l’immunodétection pour ces protéines comme procédure efficace et sensible pour la surveillance de l’induction et de la réparation de l’ADN-DSB. Jusqu’à présent, il n’y avait pas de données disponibles sur les ADN-DSB basées sur des foyers de protéines de réparation au niveau cellulaire après l’irradiation à faisceau mixte de neutrons pour BNCT, à l’exception des marqueurs γ-H2AX et 53BP119. Nous suggérons l’adaptation de la ligne de cellules cancéreuses du côlon HCT-116, car elle est elle-même riche en foyers DSBs, comme une ligne cellulaire standard pour l’analyse des dommages de l’ADN, parce que les RIF sont facilement détectables. Cette lignée cellulaire adhérente est facile à entretenir et appropriée pour les procédures d’irradiation. La procédure proposée est basée sur une énorme quantité d’études antérieures liées à la procédure générale d’immunofluorescence de la coloration γ-H2AX. Cependant, il comprend tous les détails concernant la sélection d’anticorps appropriés avec des dilutions testées pour chaque protéine représentative appartenant à chaque voie de réparation. En outre, il décrit l’utilisation d’un faisceau unique à neutrons mélangé utilisé dans la thérapie BNCT. Cependant, nous recommandons d’étendre les études avec les deux méthodes, l’immunofluorescence coloration d’abord, puis, avec une analyse moléculaire à coût élevé comme effectué précédemment4,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les fréquences des foyers, immunochimiquement tachées pour γ-H2AX et 53BP1 sont couramment utilisées en radiobiologie et sont associées au numéro DNA-DSB et sont considérées comme des marqueurs efficaces et sensibles pour la surveillance de l’induction et de la réparation des ADN-DSB19. La procédure de co-coloration de γ-H2AX et 53BP1 est une procédure standard pour la détection de l’ADN-DSB. Formation de γ-H2AX foyers est associée au recrutement de 53BP1, un régulateur de la r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le faisceau mixte à neutrons composé de rayonnement neutronique/gamma a été accessible à partir du réacteur de recherche Maria du Centre national de recherche nucléaire en Pologne. K.M.O. a reçu le soutien du Centre national des sciences, Pologne (Miniatura 2) au n° #2018/02/X/NZ5/02849.
Materials
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody – ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
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