ヒト大腸癌細胞におけるDNA損傷および修復病巣の免疫蛍光イメージング
Summary
ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)に用いられる中性子混合ビームによる放射線誘発DNA損傷応答は完全には確立されていない。このプロトコルは、中性子混合ビームを照射した後のヒト大腸癌細胞株における免疫蛍光染色による修復タンパク質の放射線誘発病巣(RIF)を検出するためのステップバイステップの手順を提供する。
Abstract
本稿の目的は、ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)で用いられる中性子ガンマの混合ビームによって誘導される放射線誘発DNA損傷応答を研究するための免疫蛍光顕微鏡を実施するためのステップバイステップのプロトコルを提供することにある。具体的には、DNA二本鎖切断(DNA-DSB)に特異的な抗体を用いて病巣として可視化できる、修復タンパク質活性化の検出に提案された方法論が適用される。DNA修復病巣は、中性子混合ビームを照射した後の大腸癌細胞(HCT-116)における免疫蛍光によって評価した。DNA-DSBは最も遺伝子毒性の病変であり、哺乳類細胞では、非相同のエンド結合経路(NHEJ)および相同組換え修復(HRR)の2つの主要経路によって修復される。γ-H2AXのような放射線生物学で一般的に使用されるマーカーについては、病巣の周波数は、免疫化学的染色、53BP1はDNA-DSB数に関連しており、DNA-DSBの誘導および修復を監視するための効率的で敏感なマーカーと考えられている。γ-H2AX病巣が修復タンパク質を引き付け、DSB付近の修復因子の濃度が高いことが確立されました。細胞レベルでのDNA損傷をモニタリングするために、NHEJ経路からのDNA-PKcs代表的な修復タンパク質病巣およびHRR経路からのRad52の存在に対する免疫蛍光分析が計画された。NHEJおよびHRR経路からの修復因子に特異的な抗体を用いた放射線誘発DNA損傷応答の検出および放射線誘発病巣(RIF)の観察のための信頼できる免疫蛍光染色プロトコルを開発し、導入しました。提案された方法論は、中性子混合ビーム放射の場合に高度に活性化される修復タンパク質の調査に使用することができ、それによって修復経路の優位性を示す。
Introduction
ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)で使用される中性子混合ビームにより活性化された放射線によるDNA損傷応答は完全には決定されていない。このプロトコルは、免疫蛍光染色による修復タンパク質の放射線誘発病巣(RIF)の検出を、例えば、中性子混合ビームで照射した後のヒト大腸癌細胞株において、ステップバイステップの手順を提供する。
電離放射線(IR)は、DNA二本鎖の破断が最も遺伝子毒性のDNA病変であるDNA損傷(DNA-DSB、DNA-SSB、DNA塩基損傷)の多くの異なるタイプを誘導する。修復されていない休憩は細胞死を引き起こす可能性があり、誤って修復された休憩は染色体の再配置、突然変異、決定的な遺伝情報の喪失の確率を高める。DSBに応答する損傷応答経路には、非相同端結合(NHEJ)のようなDNA修復経路、Ku 70/80、DNA-PKcs、Xrcc4、およびDNAリガーゼIVを主要因子22、3、4、5、63,4,5,6として必要とするメカニズムが含まれる。哺乳類では、第2の主なDNA修復経路は、重要な構成要素を必要とする相同組換え修復(HRR)経路である – Rad52エピスタシス遺伝子ファミリー – Rad51、Rad52、Rad54、Rad55、Rad57およびRad587。Rad51とRad54は、真核生物の複製ストレスやDNA切断に関連する修復メカニズムに関与する重要なヒト再結合因子です。興味深いことに、HRR経路のダウンレギュレーションは、ゲノム安定性8に対するHR経路の関連性を指し示す誤差を起こしやすいNHEJ経路を増強することが観察された。
DSBs形成の第一段階は、PI3キナーゼファミリー77,88から運動失調性血管拡張症変異キナーゼ(ATM)によるSer-139におけるγ-H2AXヒストンのリン酸化である。興味深いことに、H2AXリン酸化は、リン酸化H2AX6に特異的な抗体を用いた病巣(γ-H2AX病巣)としての蛍光免疫技術によって容易に可視化することができる。6DSBとγ-H2AX病巣の数には1:1の関係があり、したがって、DSBマーカーであるγ-H2AX,は、病巣形成、サイズ、および量,,6、7、8、9、10、117の特性を通じて広範囲に研究されている。10,11689γ-H2AX病巣の形成は、53BP1(p53結合タンパク質1)、MDC1(DNA損傷チェックポイントのメディエーター)、BRCA1、Mre11/Rad50/Nbs1、PARP-1、および他の多くの修復因子などのDNA損傷応答(DDR)タンパク質およびクロマチン修飾因子の募集および蓄積につながる。これらのタンパク質はすべて、直接または間接結合1、11、12,11を介してγ-H2AXと12共に局地化する。
DNA損傷を検出し、適切な敏感なテストで修復することが重要であり、したがって、より注意が高い精度の技術13の開発に支払われます。DNA損傷および修復研究の文脈において、方法論はゲノムDNA損傷の敏感検出、損傷カテゴリーの記述、およびDNA損傷および修復機構の定量化13にとって極めて重要である。DNAを損傷した単一細胞を検出するために、彗星アッセイは、放射線生物学的研究14で一般的に使用される。他の利用可能な細胞遺伝学的方法は、二心、転位、アセントリックフラグメント、環状、クロマチド型収差、および微小染色体損傷(Mn)を含む染色体収差を認識する。放射線生物学で最も頻繁に使用される方法は、特に生物学的線量測定において、放射線15に対するその高い特異性による二心染色体アッセイである。例えば、古典的な分子法であるPCRは、検出されたDNA損傷の種類を認識できない。この場合、免疫学的方法は、抗原と抗体の間に特異的な反応があるため、感度レベルを通過する。免疫蛍光イメージングは、電離放射線16のようなDNA損傷剤に応答して、異なる病巣中の異なるタンパク質の出現に関する視覚的証拠を提供する。しかし、dna損傷応答17の関連においてさらなる分子研究のための適切な定量的方法であるリアルタイムPCRにより、損傷および修復タンパク質のmRNAレベルの活性化レベルを容易に検出できる。
γ-H2AX病巣が修復因子18を引き付けることを考慮し、細胞レベルでのDNA損傷および修復を監視するために、HRR経路からのNHEJ経路(DNA-PKcs)およびRad52からの代表的な修復タンパク質病巣の分析に基づいて、信頼性の高い免疫蛍光染色法を開発した。
ここでは、DNA-DSBの誘導・修復をモニタリングするための効率的かつ高感度な方法として、これらのタンパク質に対する免疫検出の利用を提案する。これまで、bnCTに対する中性子混合ビーム照射後の細胞レベルにおける修復タンパク質の病巣に基づくDNA-DSBに関する利用可能なデータは、γ-H2AXおよび53BP1マーカー19を除く。我々は、AIFが容易に検出可能であるため、DNA損傷分析のための標準的な細胞株として、DSB病巣に富んでいるため、HCT-116大腸癌細胞株の適応を提案する。この付着細胞株は、照射手順のために維持しやすく、適切である。提案された手順はγ-H2AX染色の一般的な免疫蛍光手順に関連する膨大な量の以前の研究に基づいている。しかし、各修復経路に属する各代表的なタンパク質に対して、試験された希釈を伴う適切な抗体の選択に関するすべての詳細が含まれる。さらに、BNCT療法で使用されるユニークな中性子混合ビームの利用について述べている。しかし、我々は、免疫蛍光染色を、先に,4、17を行った高コストの分子分析を用いて、両方の方法で研究4を拡張することを推奨する。
Protocol
Representative Results
Discussion
γ-H2AXおよび53BP1に対して免疫染色された病巣の周波数は、放射線生物学において一般的に使用され、DNA-DSB数と関連しており、DNA-DSBs19の誘導および修復をモニタリングするための効率的で敏感な19マーカーと考えられている。γ-H2AXおよび53BP1の共染色手順は、DNA-DSBの検出のための標準的な手順である。23しかしながら、異なる細胞株はγ-H2AX/53BP1病巣<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
中性子/ガンマ線で構成された中性子混合ビームは、ポーランド国立原子核研究センターのマリア研究炉からアクセスされた。K.M.O.は、ポーランド国立科学センター(Miniatura 2)助成金#2018/02/X/NZ5/02849によって支援されました。
Materials
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody – ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
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