Kanser hücrelerinin transplantasyonu, kanser mekanizmalarının ve terapötik tepkilerin tanımlanması için önemli bir araçtır. Mevcut teknikler, bağışıklık yetersiz hayvanlara bağımlıdır. Burada, tümör hücresi davranışının ve in vivo ilaç yanıtlarının uzun vadeli analizi için immün yetkin embriyolara zebra balığı tümör hücrelerini nakletmek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Tümör hücresi transplantasyonu, kanser hücresi büyümesi, göç ve konukçu yanıtını kontrol eden mekanizmaları tanımlamak ve tedaviye potansiyel hasta yanıtını değerlendirmek için önemli bir tekniktir. Mevcut yöntemler, tümör greftinin reddinden kaçınmak için, syngeneic veya bağışıklık sistemi zayıflatılmış hayvanların kullanılmasına büyük ölçüde bağımlıdır. Bu yöntemler, genellikle bağışıklık-tümör hücresi etkileşimlerinin analizini engelleyen ve / veya spesifik genetik geçmişlerle sınırlı olan spesifik genetik kökenlerin kullanılmasını gerektirir. Zebrafish'de alternatif bir yöntem, 3 gün önce embriyonik beynin tamamlanmamış bağışıklık sisteminden yararlanır ve burada tümör hücreleri kısa vadeli tahliller ( yani 3-10 gün) için nakledilir. Bununla birlikte, bu yöntemler, tümör hücresi davranışının ve ilaç tepkisinin uzun süreli çalışılmasını engelleyen konakçı öldürücüğe neden olur. Bu protokol, zebrafish beyin tümörü dokusunun uzun vadeli ortotopik transplantasyonu için basit ve etkili bir yöntem açıklamaktadır.2 günlük bağışıklık yeteneğine sahip bir zebra bifsi dördüncü ventriküle. Bu yöntem şunları sağlar: 1) istila ve yayma gibi tümör hücresi davranışlarının uzun süreli çalışılması; 2) uyuşturucuya dayanıklı tümör tepkisi; Ve 3) tümör gelişiminin incelenmesi ve / veya farklı konakçı genetik kökenlerin etkisi için tümörlerin yeniden transplantasyonu. Özetle, bu teknik, kanser araştırmacılarına uzak aylardaki engraftment, istila ve büyümeyi değerlendirmelerine izin verirken, aynı zamanda birçok ay boyunca kimyasal ekranlar ve hücre rekabeti analizleri yapmaya izin verir. Bu protokol, diğer tümör tiplerine yönelik çalışmalara kadar genişletilebilir ve kemorezistans ve metastaz mekanizmalarını aydınlatmak için kullanılabilir.
Tümör hücrelerinin bağışıklık sistemi zayıflatılmış hayvanlara, özellikle fare ksenograftlarına transplantasyonu, kanser hücresi çoğalması 1 , 2 , sağkalım, istila ve metastazı 3 , 4 kontrol eden mekanizmaların incelenmesinde ve bir platform sağlamak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir Ilaçların taranması için 5 , 6 , 7 . Daha yakın zamanlarda, primer tümör numunelerinin bağışıklık sistemi zayıflatılmış farelere transplantasyonu, tanı ve klinik öncesi ilaç tarama amaçları için hastadan türeyen ksenograft (PDX) modelleri üretmek için kullanılmıştır ve kişiselleştirilmiş ilaç girişiminin omurgasıdır 8 , 9 , 10 , 11 . Bununla birlikte, önemli kanıtlar, immün sistemin modüle edilmesininKök, tümör davranışı ve hasta sonuçları üzerinde dramatik bir etkiye sahip olabilir 12 , 13 . Bu, xenografta dayalı tekniğin, insan bağışıklık hücrelerinin tümör hücreleri ile birlikte nakledilmesiyle fare bağışıklık sisteminin yeniden yapılandırıldığı "hümanize" farelerin yeniden tasarlanmasını sağlamıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşım tekniğe bağlı değişken tekrarlanabilirlik ve toksisitelerle birlikte halen teknik açıdan zorlayıcıdır, buna ek olarak önemli maliyet 14,15. Bu nedenle, bağışıklık yeterliliğine sahip hayvanlarda yeni transplantasyon tekniklerine, bağışıklık ve tümör spesifik kanser progresyonu ve ilaç tepkisi mekanizmalarının keşfedilmesini hızlandırmak için ihtiyaç duyulmaktadır.
Zebra balığı, insan kanserinin araştırılması için alternatif bir hayvan modelidir ve 20'den fazla kanser modeli kurulmuştur ve bunlarda 16 , son derece habis beyin 17 , mela Noma 18 , 19 , 20 ve pankreas kanseri 21 , 22'nin yanı sıra birçok lösemi 23 , 24 , 25 , 26 , 27'yi içerir . Zebra balığı sisteminin iki özelliği, kanser araştırmaları için özellikle müsait olmasını sağlar: 1) saydam hayvanların optik berraklığı, basit mikroskopi teknikleri kullanılarak kanser hücre davranışlarının ( ör. Çoğalma, hayatta kalma, istila ve yayılma) doğrudan görselleştirilmesine olanak tanır ve 2) Dişi zebra balığı, günde 200 embriyo üretebilir ve düşük sayıyla genetik veya uyuşturucu taramasında hızlı hayvan sayısının ölçeklenmesine izin verir. Buna ek olarak, zebra balığı ve insanların kanser genomları (onkogenler ve tümör süpresör genler dahil) oldukça korunumludurF "> 28, mekanik ve uyuşturucu keşiflerinin memelilere hızla çevrilmesine izin veren bu özellikler, zebra balığı, görüntüleme, ölçeklenebilirlik ve sistemin düşük maliyetinden yararlanan transplantasyon teknikleri için ideal bir hayvan modeli haline getirir.
Bağışıklık-zedelenmiş zebrafish'de önceki tümör nakli çalışmaları, kendini yenileme kabiliyetlerinin, tümör malignitelerinin ve istilanın / yayılmanın tanımlanmasını kolaylaştırdı 11,29. Bağışıklık sistemleri yaklaşık 20 gün 11 , 30 boyunca etkili şekilde bastırılmış γ-ışınlarına maruz kalmış erişkinlere transplantasyon yapıldıktan sonra tümör hücresi davranışına ilişkin kısa vadeli çalışmalar yapılabilir. Yetişkin zebrafish'in deksametazon ile tedavisi reddedilmeden önce 30 güne kadar B ve T hücrelerini bastırır 31 . Daha az yaygın bir diğer strateji klonal zebra balığı soyları kullanmaktadırBağışıklık sahibi bir evsahipliğinde uzun vadeli araştırmaları mümkün kılan 32 . Bununla birlikte, sınırlı sayıdaki klonal suşlar üretilmiştir ve doğurganlığın düşük olması nedeniyle sürdürülmesi zordur. Buna ek olarak, kurulan zebra balığı tümör modellerinin çoğu diğer genetik kökenlerde üretilir, bu nedenle bu tümörler bağışıklık sistemini baskılamadan klonal suşlara nakledilemezler 11 , 33 , 34 . Uzun vadeli transplantasyon çalışmalarını iyileştirmeye yönelik daha yeni yaklaşımlar, çoklu kanserleri başarıyla nakletmek için kullanılan 35 ve 36 nolu başarıyla kullanılan B ve T hücre işlevleri ile birlikte rag2 E450fs mutant hattının geliştirilmesini içermektedir. Klon zebra bağı soyları veya bağışıklık sistemi tehlikeye atılan bir ev sahibi için gereksinimi ortadan kaldırmak için, bazı gruplar erken aşamadaki embriyoları kullandı ( yani, > 72 hpOst-fertilizasyon (hpf)), bu embriyolar henüz 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 adaptif bir bağışıklık sistemi geliştirmediğinden insan tümör hücresi transplantasyonu için. Bununla birlikte, bu yöntemler, insan kanseri hücrelerinin veya transplantasyon tekniğinin kendisinin kendisini öldürdüğü, uzun süreli çalışmaları ve yeniden nakilleri önlediği için, tümör hücresi davranışının veya ilaç tepkisinin kısa vadeli analizi ile sınırlıdır (genellikle 2 haftadan az).
Bu protokol, 2 gün sonrası dölleme (dpf) embriyo beyninin dördüncü ventrikülünün lümenine modifiye edilmiş embriyonik transplantasyon yöntemini ayrıntılarıyla anlatmaktadır. Ev sahibi toksisite en aza indirir ve tümör hücrelerinin uzun vadeli engraftment için zebra balığı beyin tümörü modelleri ile kombine edilebilir. Böylece, bu teknikTümör hücrelerinin yeni nesillere yeni nesillere yeniden nakli yapılması, tümör heterojenitesi, konak / immün yanıtlar, ilaç yanıtları veya metastatik potansiyel üzerine gelecekteki çalışmaların kolaylaştırılması için düşüktür. Bu yöntem aynı zamanda basit, verimli ve ölçeklenebilir, çünkü günde tek bir kullanıcı tarafından 300 nakil yapılabilir,% 90'a kadar engraftment uygulanır. Bu, tek primer tümörlerin genetik veya ilaç tarama projeleri için 2 dpf'de yüzlerce embriyoya hızlı bir şekilde yayılmasına veya birkaç ay boyunca farklı ana bilgisayar geçmişinde beyin tümör hücresi davranışını doğrudan görselleştirmesine olanak tanır.
Bu protokol, tam yetkili bir bağışıklık sistemi geliştirecek bir 2-dpf embriyonunun ventrikülüne zebra balığı tümör hücrelerinin enjeksiyonunu içeren basit ve etkili bir nakil testini ayrıntılarıyla anlatmaktadır. Şu ana kadar, zebra balığı CNS-PNET 17 ve melanoma (veriler gösterilmemiştir), tümör hücresi davranışı ve istilasına ilişkin uzun vadeli çalışmalar için başarıyla nakledilmiştir. Bu protokolün kritik aşamaları, uygun iğne deliği boyutunu ve uygun tümör hücresi süspansiyonunu ve konakçı embriyoları yeterince anestezi altına almayı içerir. Her bir araştırmacı için, bu tekniğin daha da optimizasyonu, tümör hücre konsantrasyonunun, enjeksiyon basıncının ve embriyo yönlendirmesinin ayarlanmasını içerebilir. Buna ek olarak, farklı tümörlerden kaynaklanan süspansiyonların viskozitesinde heterojenlik olabilir, bu nedenle farklı tümör tipleri, yeniden askıya alma ve nakil için az çok zor olabilir. Bununla birlikte, iğne deliği boyutunu ayarlayarak ve farklıTümör süspansiyonunun kiralık seyreltmelerinde, tümör viskozitesi ile ilgili zorlukların üstesinden gelmek mümkündür.
Deneyimimizde, seyrek hücrelerin / ventriküldeki tutarsız hücre kitlelerinin en yaygın nedenleri şunlardır: 1) tümör hücresi süspansiyonu çok seyreltik; 2) iğne deliği boyutu çok küçük; 3) enjeksiyon süresi ve basıncı çok düşük; Ve / veya 4) kalan doku tümörden filtrelenmedi ve iğneye yerleştirildi. Enjeksiyondan sonra tümör hücresi süspansiyonu ventrikülden dışarı aktığında muhtemelen: 1) iğnenin ventrikül tabanına yerleştirilmesi; 2) yüksek bir enjeksiyon basıncı ve zamanı; Ve / veya 3) çok büyük bir iğne deliği ebadı. Nakledilen embriyoların düşük sağkalımı, şu nedenlerden kaynaklanabilir: 1) embriyoları uzunca bir süre anestezikle; 2) enjeksiyon plakasındaki embriyoların kuruması için bırakılması; 3) hava kabarcıklarının ventriküle enjekte edilmesi; Ve / veya 4) beyin gibi yaşamsal organların delinmesi veKalp, çünkü iğne ventrikül içinden geçti.
Yetişkinlerde veya embriyonik zebra balığı beyindeki önceki tümör transplantasyon yöntemleri, yetişkinlerde (genetik olarak, farmakolojik olarak veya radyasyon yoluyla) immün baskılamaya dayanır veya embriyonlardaki 38 , 43 , 52 , 53 , 54'teki insan veya fare hücrelerinin kısa süreli çalışmaları ile sınırlıdır . Örneğin, fare beyin tümörleri, kısa süreli (~ 2 gün) klinik öncesi ilaç tahlilleri 54 için deksametazon-immüno-baskılanmış, 30-dpf, küçük yaştaki zebrafish içine intranazal olarak enjekte edilebilir 54 . Bununla birlikte, bu deneylerde enjeksiyon yeri kafatası ve beyin dokusu tarafından örtülmüş ve muhtemelen normal beyin dokularına zarar verecek ve konakçı yaşayabilirliğini ve engraftman etkinliğini azaltacaktır. Yakın zamanda tarif edilen diğer bir metot, insan gliobununInvazyon ve uyuşturucu tepkisinin kısa vadeli analizini mümkün kılan zebra balığı embriyolarının orta beyin bölgesine dönüştürülmesi. Yine, enjeksiyon alanının kesin konumu değişkendir ve muhtemelen normal dokuya zarar verir. Dolayısıyla embriyonik beyin transplantasyonlarının daha önceki yöntemleri, bu çalışmaların kısa vadeli analizlerle ( yani 2 ila 14 gün arasında) sınırlandırılması nedeniyle, konakçıların yaşayabilirliğini tehlikeye atarak, belirsiz enjeksiyon bölgelerinden dolayı bireysel enjeksiyonlar arasında değişkenlik artıyor ve uzun süreli anti- Hücre davranışlarının ve ilaç yanıtlarının ya da çok nesiller boyunca yeniden transplantasyonun uzun vadeli analizi.
Burada açıklanan yöntem, zebrafish embriyonik ve bağışıklık sistemi zayıflatılmış transplantasyon tekniklerindeki mevcut kısıtlamaları ele almaktadır; bunlar, araştırmacıların şunları yapmalarına olanak tanır: 1) Çevredeki dokuya asgari zarar verilerek tekrarlanabilir şekilde enjekte edilir; 2) enjeksiyon alanını doğrudan en üst düzeye çıkarmak için görselleştirin.Engraftment verimliliği; 3) günde yüzlerce embriyo nakli; 4) tümörlerin bağışıklık kazanmış hayvanlarda büyümesine izin verin; 5) zebra balığı ömrü boyunca tümör hücresi davranışı ve dayanıklı ilaç tepkilerinin izlenmesine izin vermek; Ve 6) tümör gelişiminde veya ilaç relaps mekanizmalarında potansiyel çalışmalar için birçok kuşağa tümörlerin yeniden nakline izin verir. Ayrıca, bu protokol, araştırmacıların, farklı bağışık nüfuslar da dahil olmak üzere, konukçu yanıtını değerlendirmek için herhangi bir zebra balığı genotipini kullanmalarını sağlar. Bu öznitelikler, bu yöntemi zaten zebrafish'te standart mikroenjeksiyonlar gerçekleştiren herhangi bir laboratuvar tarafından kolayca adapte edilebilir hale getirir. Son olarak, bu yöntem zebrafish beyin tümörlerinin ortotop enjeksiyonları için ideal olsa da, karaciğer veya pankreas gibi diğer tümör tiplerini naklederken, ortotopik bölge bağışıklık yeterliliğinden daha önemli olabilir ( örneğin, bir araştırmacı, stromal Mikro çevre, tümör büyümesi). Bu senaryoda,Yeni geliştirilen immün yetersiz zebrafish modelleri, ortotopik tümör transplantasyonlarının yapılması için daha uygun olabilir 11 .
Bu protokol, tümör hücresi rekabet testlerini yapmak ve ikili etiketli tümörleri enjekte etmek için kullanılmıştır. Ayrıca ilacın suya ilavesiyle transplant sonrası embriyoların tedavisini içeren kimyasal bileşiklerin tümörojenez üzerindeki etkinliğinin değerlendirilmesi için potansiyel bir tedavi stratejisi de tartışılmıştır. Transplantasyondan önce tümör hücrelerinin ex vivo tedavisi için bir yöntem daha önce bildirilmiştir17. Ek olarak, nakledilen tümörler, tümör gelişimi ve kemorezistans 17 çalışmalarında faydalı olacak çok turlu yeniden nakil için toplanmıştır. Şu anda, klinik öncesi çalışmalar, potansiyel bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek için fare zenogreftlerine bağımlıdır. Bununla birlikte, bu çalışmalar çok zaman alıcıVe masraflı. Zebra balığı ile insanlar arasındaki onkojenik sinyal yollarının yüksek derecede korunması göz önüne alındığında, bu yöntemin, klinik öncesi ve klinik denemelere giren etkili bileşiklerin daha hızlı tanımlanabilmesini sağlamak için konvansiyonel fare ve insan hücre çalışmalarını tamamlaması beklenebilir. Sonuçta bu yöntem, birincil hasta tümörlerinin hızlı kimyasal taramasında yararlı olabilir ve bu da kişiselleştirilmiş ilaç girişimini ilerletebilir. Ancak, zebra balığı (yetişkin veya embriyo) insan hücrelerinin uzun vadeli büyüme koşulları belirlenmelidir.
The authors have nothing to disclose.
Makaledeki mükemmel öneriler ve geliştirmeler için iki yorumcuya teşekkür ediyoruz. Hayvan yetiştiriciliği ve bakımı için Huntsman Kanser Enstitüsü / Utah Üniversitesi'ne teşekkür ediyoruz. Bu çalışma Amerikan Kanser Derneği (# 124250- RSG-13-025-01-CSM), bir NIH hibe (P30 CA042014 CRR programı), Utah Üniversitesi Tohum Hibe Üniversitesi ve Huntsman Kanser Vakfı tarafından finanse edildi.
Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
50 ml beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
1000 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
100 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
50 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
15 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
1.7 ml microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |