Die Transplantation von Krebszellen ist ein wichtiges Instrument zur Identifizierung von Krebsmechanismen und therapeutischen Reaktionen. Aktuelle Techniken hängen von immune-inkompetenten Tieren ab. Hier beschreiben wir eine Methode zur Transplantation von Zebrafisch-Tumorzellen in immunkompetenten Embryonen zur Langzeitanalyse des Tumorzellverhaltens und in vivo- Arzneimittelwirkungen.
Tumorzelltransplantation ist eine wichtige Technik, um die Mechanismen zu bestimmen, die das Krebszellwachstum, die Migration und die Wirtsreaktion kontrollieren sowie die potentielle Reaktion des Patienten auf die Therapie beurteilen. Die derzeitigen Methoden hängen weitgehend von der Verwendung von syngenen oder immunkompromittierten Tieren ab, um eine Ablehnung des Tumortransplantats zu vermeiden. Solche Verfahren erfordern die Verwendung spezifischer genetischer Stämme, die oft die Analyse von Immun-Tumor-Zell-Interaktionen verhindern und / oder auf spezifische genetische Hintergründe beschränkt sind. Eine alternative Methode in Zebrafisch nutzt ein unvollständig entwickeltes Immunsystem im embryonalen Gehirn vor 3 Tagen, wo Tumorzellen zur Verwendung in Kurzzeit-Assays ( dh 3 bis 10 Tage) transplantiert werden. Allerdings verursachen diese Methoden die Host-Letalität, die die Langzeitstudie des Tumorzellverhaltens und der Wirkstoffreaktion verhindert. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und effiziente Methode für die langfristige orthotopische Transplantation von Zebrafisch Hirntumor Gewebe inZum vierten Ventrikel eines 2 Tage alten immunkompetenten Zebrafischs. Diese Methode erlaubt: 1) Langzeitstudie von Tumorzellverhalten, wie Invasion und Verbreitung; 2) haltbare Tumorreaktion auf Drogen; Und 3) Re-Transplantation von Tumoren für das Studium der Tumor Evolution und / oder die Auswirkungen der verschiedenen genetischen genetischen Hintergründe. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Krebsforscher die Transplantation, Invasion und das Wachstum an entfernten Standorten beurteilen sowie chemische Bildschirme und Zellwettbewerbstudien über viele Monate durchführen können. Dieses Protokoll kann auf Studien anderer Tumortypen erweitert werden und kann zur Aufklärung von Mechanismen der Chemoresistenz und Metastasen verwendet werden.
Die Transplantation von Tumorzellen in immungeschädigte Tiere, insbesondere Maus-Xenotransplantate, ist eine weit verbreitete Technik, die zur Untersuchung von Mechanismen zur Kontrolle der Krebszellproliferation 1 , 2 , des Überlebens, der Invasion und der Metastase 3 , 4 sowie zur Bereitstellung einer Plattform verwendet wird Zum Screening von Medikamenten 5 , 6 , 7 . In jüngster Zeit wurde die Transplantation von primären Tumorproben in immunkompromittierte Mäuse zur Generierung von Patient-Xenotransplantatmodellen (PDX) für diagnostische und präklinische Arzneimittel-Screening-Zwecke verwendet und ist das Rückgrat der personalisierten Arzneimittelinitiative 8 , 9 , 10 , 11 . Allerdings zeigen signifikante Beweise, dass die Modulation des ImmunsystemsStamm kann einen dramatischen Einfluss auf das Tumorverhalten und das Patientenergebnis haben 12 , 13 . Dies hat die Neugestaltung von Xenotransplantat-Techniken getrieben, um "humanisierte" Mäuse einzuschließen, in denen das Immunsystem der Maus durch Co-Transplantation menschlicher Immunzellen mit Tumorzellen rekonstituiert wird. Allerdings ist dieser Ansatz immer noch technisch anspruchsvoll, mit variabler Reproduzierbarkeit und Toxizitäten im Zusammenhang mit der Technik, zusätzlich zu den erheblichen Kosten 14 , 15 . So sind neue Transplantationstechniken in immunkompetenten Tieren erforderlich, um die Entdeckung von immun- und tumorspezifischen Mechanismen der Krebsentwicklung und der Wirkstoffreaktion zu beschleunigen.
Zebrafisch sind ein alternatives Tiermodell für das Studium von menschlichem Krebs, mit über 20 Krebsmodellen jetzt etabliert 16 , einschließlich hoch bösartiges Gehirn 17 , Mela Noma 18 , 19 , 20 und Pankreaskarzinome 21 , 22 sowie viele Leukämien 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Zwei Attribute des Zebrafisch-Systems machen es besonders für die Krebsforschung zugänglich: 1) Die optische Klarheit der lichtdurchlässigen Tiere ermöglicht die direkte Visualisierung von Krebszellverhalten ( dh Proliferation, Überleben, Invasion und Verbreitung) mit einfachen Mikroskopietechniken und 2) Weibliche Zebrafisch kann bis zu 200 Embryonen pro Tag produzieren, so dass die schnelle Skalierung von Tierzahlen für genetische oder Drogen-Screening zu niedrigen Kosten. Darüber hinaus sind die Krebsgenome von Zebrafisch und Menschen hoch konserviert (einschließlich Onkogene und Tumorsuppressorgene)F "> 28, so dass mechanistische und medikamentöse Entdeckungen schnell in Säugetiersysteme umgesetzt werden können. Diese Attribute machen auch den Zebrafisch zu einem idealen Tiermodell für Transplantationstechniken, die die Bildgebung, Skalierbarkeit und niedrige Kosten des Systems nutzen.
Bisherige Tumortransplantationsstudien in immun-kompromittiertem Zebrafisch haben die Identifizierung von Selbsterneuerungsfähigkeiten, Tumor-Malignität und Invasion / Verbreitung erleichtert 11 , 29 . Kurzzeitstudien des Tumorzellverhaltens können nach der Transplantation in γ-bestrahlte Erwachsene durchgeführt werden, deren Immunsysteme für ~ 20 Tage 11 , 30 wirksam unterdrückt werden. Die Behandlung von adultem Zebrafisch mit Dexamethason unterdrückt B- und T-Zellen für bis zu 30 Tage vor Ablehnung 31 . Eine andere, weniger gängige Strategie setzt klonale Zebrafischstämme einDie Langzeituntersuchungen in einem immunkompetenten Wirt ermöglichen 32 . Allerdings wurde nur eine begrenzte Anzahl von Klonstämmen erzeugt und sind aufgrund der niedrigen Fruchtbarkeit schwer zu halten. Darüber hinaus werden die meisten der etablierten Zebrafisch-Tumormodelle in anderen genetischen Hintergründen erzeugt, so dass diese Tumoren nicht in die Klonstämme transplantiert werden können, ohne das Immunsystem 11 , 33 , 34 zu unterdrücken. Neuere Ansätze zur Verbesserung der Langzeit-Transplantationsstudien beinhalten die Entwicklung der rag2 E450fs- Mutantenlinie mit kompromittierten B- und T-Zell-Funktionen, mit denen mehrere Krebsarten erfolgreich transplantiert wurden 35 , 36 . Um die Anforderung an klonale Zebrafisch-Linien oder einen immun-kompromittierten Wirt zu umgehen, haben eine Reihe von Gruppen Frühphasen-Embryonen ( dh > 72 PS) verwendetOst-Befruchtung (hpf)) für die menschliche Tumorzelltransplantation, da diese Embryonen noch kein vollkommenes adaptives Immunsystem 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 entwickelt haben. Allerdings sind diese Methoden auf die kurzfristige Analyse des Tumorzellverhaltens oder der Drogenreaktion (in der Regel weniger als 2 Wochen) beschränkt, da die menschlichen Krebszellen oder die Transplantationstechnik selbst den Wirt töten, Langzeitstudien und Re-Transplantation verhindern.
Dieses Protokoll beschreibt eine modifizierte embryonale Transplantationsmethode in das Lumen des vierten Ventrikels eines 2-Tage-nach-Befruchtung (dpf) Embryo-Gehirns. Es minimiert die Toxizität gegenüber dem Wirt und kann mit Zebrafisch-Hirntumormodellen für die langfristige Verpflanzung von Tumorzellen kombiniert werden. So ist diese Technik alTiefs für die Re-Transplantation von Tumorzellen in neue Wirte über viele Generationen hinweg, erleichtert zukünftige Studien über Tumor-Heterogenität, Wirts- / Immunantworten, Arzneimittelwirkungen oder metastatisches Potential. Diese Methode ist auch einfach, effizient und skalierbar, da bis zu 300 Transplantationen von einem einzelnen Benutzer pro Tag mit bis zu 90% Engagement durchgeführt werden können. Dies ermöglicht die rasche Ausbreitung einzelner Primärtumoren in Hunderte von Embryonen bei 2 dpf für genetische oder Arzneimittel-Screening-Projekte oder um das Hirntumorzellverhalten in verschiedenen Wirtshintergründen über viele Monate direkt zu visualisieren.
Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen und effizienten Transplantationstest, der die Injektion von Zebrafisch-Tumorzellen in den Ventrikel eines 2-dpf-Embryos beinhaltet, der ein vollständig kompetentes Immunsystem entwickeln wird. Bisher wurden Zebrafisch-ZNS-PNET 17 und Melanom (Daten nicht gezeigt) erfolgreich für Langzeitstudien des Tumorzellverhaltens und der Invasion verpflanzt. Die kritischen Schritte dieses Protokolls umfassen die Sicherstellung der geeigneten Nadelbohrungsgröße und der richtigen Tumorzellsuspension und adäquater Anästhesierung von Wirtsembryonen. Für jeden einzelnen Forscher kann eine weitere Optimierung dieser Technik die Einstellung der Tumorzellkonzentration, des Injektionsdrucks und der Embryo-Orientierung umfassen. Darüber hinaus kann es Heterogenität in der Viskosität von Suspensionen geben, die aus verschiedenen Tumoren stammen, so dass unterschiedliche Tumortypen mehr oder weniger schwer wieder suspendiert und transplantiert werden können. Durch Einstellen der Nadelbohrungsgröße und durch Verwendung von diffeMieten Verdünnungen der Tumorsuspension, ist es möglich, Schwierigkeiten mit Tumor-Viskositäten zu überwinden.
In unserer Erfahrung sind die häufigsten Gründe für spärliche Zellen / inkonsistente Zellmassen im Ventrikel wie folgt: 1) die Tumorzellsuspension ist zu verdünnt; 2) die Nadelbohrung ist zu klein; 3) die Einspritzzeit und der Druck sind zu niedrig; Und / oder 4) verbleibendes Gewebe wurden nicht aus dem Tumor gefiltert und in der Nadel untergebracht. Wenn die Tumorzellsuspension nach der Injektion aus dem Ventrikel fließt, ist es wahrscheinlich: 1) die Platzierung der Nadel gegen den Boden des Ventrikels; 2) ein hoher Einspritzdruck und Zeit; Und / oder 3) eine Nadelbohrungsgröße, die zu groß ist. Niedriges Überleben von transplantierten Embryonen kann verursacht werden durch: 1) Anästhesieren von Embryonen für einen längeren Zeitraum; 2) Embryonen auf der Injektionsplatte zu trocknen lassen; 3) die Injektion von Luftblasen in den Ventrikel; Und / oder 4) Durchdringung lebenswichtiger Organe, wie das Gehirn undHerz, weil die Nadel durch den Ventrikel ging.
Bisherige Methoden der Tumortransplantation im adulten oder embryonalen Zebrafischhirn beruhen auf der Immunsuppression bei Erwachsenen (genetisch, pharmakologisch oder über Strahlung) oder sind auf Kurzzeitstudien von menschlichen oder Mauszellen in den Embryonen 38 , 43 , 52 , 53 , 54 beschränkt . Zum Beispiel können Maus-Hirntumoren intranasal in Dexamethason-immunsupprimierten, 30-dpf, juvenile Zebrafisch injiziert werden, um kurzfristig (~ 2 Tage) präklinische Arzneimittel-Assays zu verwenden. Allerdings ist die Injektionsstelle in diesen Experimenten durch das Schädel- und Hirngewebe verdeckt und führt wahrscheinlich zu einer Beschädigung des normalen Hirngewebes, was die Lebensfähigkeit des Wirts und die Effizienz der Pflanzung verringert. Ein weiteres kürzlich beschriebenes Verfahren beinhaltet die Injektion von menschlichem GliobLastom-Zelllinien in die Mittelhirnregion von Zebrafisch-Embryonen, die die kurzfristige Analyse von Wachstum, Invasion und Drogenreaktion ermöglichten 43 . Auch hier ist die genaue Lage der Injektionsstelle variabel und vermutlich das normale Gewebe beschädigt. So beeinträchtigen frühere Methoden der embryonalen Hirntransplantationen oft die Lebensfähigkeit der Wirte, indem sie diese Studien auf eine Kurzzeitanalyse ( dh 2 bis 14 Tage) beschränken, was eine erhöhte Variabilität zwischen einzelnen Injektionen aufgrund von verdeckten Injektionsstellen bewirkt und die Langzeit- Langfristige Analyse von Zellverhalten und Drogenreaktionen oder von Re-Transplantation über mehrere Generationen hinweg.
Die hier beschriebene Methode befasst sich mit aktuellen Einschränkungen bei zebrafisch-embryonalen und immunkompromittierten Transplantationstechniken, indem sie es Forschern ermöglicht: 1) reproduzierbar in denselben Ort zu injizieren, mit minimaler Schädigung des umgebenden Gewebes; 2) direkt visualisieren die Website der Injektion zu maximierenEngagement-Effizienz; 3) Transplantation von Hunderten von Embryonen pro Tag; 4) lassen Tumore in immunkompetenten Tieren wachsen; 5) erlauben die Überwachung des Tumorzellverhaltens und der dauerhaften Arzneimittelwirkungen über die Lebensdauer des Zebrafischs; Und 6) erlauben die Re-Transplantation von Tumoren über viele Generationen für mögliche Studien über Tumor Evolution oder Drogen-Rückfall-Mechanismen. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll den Forschern, jeden Zebrafisch-Genotyp für die Beurteilung der Wirtsreaktion, einschließlich verschiedener Immunpopulationen, zu nutzen. Diese Attribute machen diese Methode leicht anpassbar durch jedes Labor, das bereits Standard-Mikroinjektionen in Zebrafisch ausführt. Schließlich, während diese Methode ideal für orthotopische Injektionen von Zebrafisch-Hirntumoren ist, können bei der Verpflanzung anderer Tumortypen wie Leber oder Pankreas die orthotopische Stelle wichtiger sein als die Immunkompetenz ( zB wenn ein Forscher die Wirkungen des Stromons untersucht Mikroumgebung auf Tumorwachstum). In diesem SzenarioNeu entwickelte, immun-defiziente Zebrafisch-Modelle können für die Durchführung von orthotopen Tumortransplantationen geeigneter sein 11 .
Dieses Protokoll wurde verwendet, um Tumorzell-Konkurrenz-Assays durchzuführen und Dual-markierte Tumore zu injizieren. Eine mögliche Behandlungsstrategie für die Beurteilung der Wirksamkeit von chemischen Verbindungen auf die Tumorentstehung, die die Behandlung von Embryonen nach der Transplantation über die Zugabe des Arzneimittels zu Wasser beinhaltet, wurde ebenfalls diskutiert. Ein Verfahren zur ex vivo- Behandlung von Tumorzellen vor der Transplantation wurde ebenfalls bereits gemeldet 17 . Darüber hinaus wurden transplantierte Tumore für mehrere Runden der Re-Transplantation gepoolt, was für Studien der Tumorentwicklung und Chemoresistenz von Vorteil sein wird. Derzeit sind präklinische Studien von Maus-Xenotransplantaten abhängig, um die Wirksamkeit potentieller Verbindungen zu beurteilen. Diese Studien sind jedoch zeitaufwändigUnd teuer. In Anbetracht des hohen Grades der Erhaltung der onkogenen Signalwege zwischen Zebrafisch und den Menschen 28 ist zu erwarten, dass diese Methode herkömmliche Maus- und menschliche Zellstudien ergänzt, um eine schnellere Identifizierung effektiver Verbindungen in präklinische und klinische Studien zu ermöglichen. Letztlich könnte sich diese Methode als nützlich für das schnelle chemische Screening von primären Patiententumoren erweisen, was die personalisierte Medizininitiative weiter vorantreiben könnte. Allerdings müssen noch Bedingungen für das langfristige Wachstum von menschlichen Zellen in Zebrafisch (Erwachsener oder Embryo) identifiziert werden.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken den beiden Rezensenten für hervorragende Anregungen und Verbesserungen des Manuskripts. Wir danken auch dem Huntsman Cancer Institute / University of Utah für die Tierhaltung und Wartung. Diese Arbeit wurde von der American Cancer Society (# 124250- RSG-13-025-01-CSM), einem NIH-Stipendium (P30 CA042014 CRR-Programm), der University of Utah Seed Grant und der Huntsman Cancer Foundation finanziert.
Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
50 ml beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
1000 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
100 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
50 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
15 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
1.7 ml microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |