La transplantation de cellules cancéreuses est un outil important pour l'identification des mécanismes du cancer et des réponses thérapeutiques. Les techniques actuelles dépendent des animaux immunitaire incompétents. Ici, nous décrivons une méthode pour transplanter des cellules tumorales de poissons zèbres en embryons immunologiquement compétents pour l'analyse à long terme du comportement des cellules tumorales et des réponses aux médicaments in vivo .
La transplantation de cellules tumorales est une technique importante pour définir les mécanismes de lutte contre la croissance des cellules cancéreuses, la migration et la réponse de l'hôte, ainsi que pour évaluer la réponse potentielle du patient au traitement. Les méthodes actuelles dépendent en grande partie de l'utilisation d'animaux syngéniques ou immunisés pour éviter le rejet du greffe de la tumeur. De telles méthodes nécessitent l'utilisation de souches génétiques spécifiques qui empêchent souvent l'analyse des interactions immunité-cellules tumorales et / ou se limitent à des antécédents génétiques spécifiques. Une autre méthode dans le poisson zèbre tire profit d'un système immunitaire incomplètement développé dans le cerveau embryonnaire avant 3 jours, où les cellules tumorales sont transplantées pour une utilisation dans des essais à court terme ( c.-à-d. 3 à 10 jours). Cependant, ces méthodes provoquent la létalité de l'hôte, ce qui empêche l'étude à long terme du comportement des cellules tumorales et de la réponse aux médicaments. Ce protocole décrit une méthode simple et efficace pour la transplantation orthotopique à long terme du tissu tumoral du cerveau zébré dansAu quatrième ventricule d'un poisson zèbre immunitaire compétent de 2 jours. Cette méthode permet: 1) étude à long terme des comportements des cellules tumorales, telles que l'invasion et la dissémination; 2) réponse tumorale durable aux médicaments; Et 3) la ré-transplantation de tumeurs pour l'étude de l'évolution de la tumeur et / ou l'impact de différents milieux génétiques de l'hôte. En résumé, cette technique permet aux chercheurs en cancérologie d'évaluer le greffe, l'invasion et la croissance sur des sites éloignés, ainsi que d'effectuer des essais chimiques et des tests de compétition cellulaire pendant de nombreux mois. Ce protocole peut être étendu aux études d'autres types de tumeurs et peut être utilisé pour élucider les mécanismes de chimisistance et de métastase.
La transplantation de cellules tumorales dans des animaux immunodépendants, en particulier des xénogreffes de souris, est une technique largement utilisée pour étudier les mécanismes de lutte contre la prolifération des cellules cancéreuses 1 , 2 , la survie, l'invasion et la métastase 3 , 4 , ainsi que pour fournir une plate-forme Pour le dépistage des médicaments 5 , 6 , 7 . Plus récemment, la transplantation d'échantillons de tumeurs primaires dans des souris immunodéprimées a été utilisée pour générer des modèles de xénogreffe dérivés du patient (PDX) pour le dépistage diagnostique et préclinique des médicaments et constitue l'épine dorsale de l'initiative de médecine personnalisée 8 , 9 , 10 , 11 . Cependant, des preuves significatives montrent que la modulation du système immunitaireLa tige peut avoir un impact dramatique sur le comportement tumoral et le résultat du patient 12 , 13 . Cela a entraîné la refonte des techniques basées sur la xénogreffe pour inclure des souris "humanisées", dans lesquelles le système immunitaire de la souris est reconstitué par la co-transplantation de cellules immunitaires humaines avec des cellules tumorales. Cependant, cette approche est encore techniquement difficile, avec une reproductibilité variable et des toxicités associées à la technique, en plus du coût important 14 , 15 . Ainsi, de nouvelles techniques de transplantation dans des animaux immunitaires sont nécessaires pour accélérer la découverte de mécanismes immunitaires et tumorales spécifiques de la progression du cancer et de la réponse aux médicaments.
Le poisson-zèbre est un modèle animal alternatif pour l'étude du cancer humain, avec plus de 20 modèles de cancer maintenant établis 16 , y compris le cerveau hautement malin 17 , mela Noma 18 , 19 , 20 et cancers pancréatiques 21 , 22 , ainsi que de nombreuses leucémies 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Deux attributs du système de poissons zèbres le rendent particulièrement propice à la recherche sur le cancer: 1) la clarté optique des animaux translucides permet la visualisation directe des comportements cellulaires cancéreux ( c.-à-d. Prolifération, survie, invasion et dissémination) en utilisant des techniques de microscopie simple et 2) Le poisson zèbre féminin peut produire jusqu'à 200 embryons par jour, ce qui permet de réduire rapidement le nombre d'animaux pour le dépistage génétique ou de médicaments à faible coût. En outre, les génomes du cancer du poisson zèbre et des humains sont hautement conservés (y compris les oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeurs)28 », ce qui permet de traduire rapidement les pratiques mécaniques et les découvertes de médicaments dans des systèmes de mammifères. Ces attributs font également du poisson zèbre un modèle animal idéal pour les techniques de transplantation, qui profitent de l'imagerie, de l'évolutivité et du faible coût du système.
Les études antérieures sur la transplantation de tumeurs dans le poisson zèbre immunodéprimé ont facilité l'identification des capacités d'auto-renouvellement, de la tumeur tumorale et de l'invasion / diffusion 11 , 29 . Des études à court terme du comportement des cellules tumorales peuvent être effectuées après une transplantation chez des adultes irradiés par γ, dont les systèmes immunitaires sont effectivement supprimés pendant environ 20 jours 11 , 30 . Le traitement du poisson zèbre adulte avec de la dexaméthasone supprime les lymphocytes B et T pendant jusqu'à 30 jours avant le rejet 31 . Une autre stratégie moins commune utilise des souches clonales de poisson zèbreQui permettent des recherches à long terme chez un hôte immunitaire compétent 32 . Cependant, seul un nombre limité de souches clonales ont été générées et sont difficiles à maintenir en raison d'une faible fécondité. En outre, la plupart des modèles établis de tumeur du poisson zèbre sont générés dans d'autres milieux génétiques, de sorte que ces tumeurs ne peuvent pas être transplantées dans les souches clonales sans supprimer le système immunitaire 11 , 33 , 34 . Des approches plus récentes pour améliorer les études de transplantation à long terme incluent le développement de la ligne de mutants E250f de rag2 , avec des fonctions de cellules B et T associées, qui a été utilisée pour réussir à transplanter des cancers multiples 35 , 36 . Pour contourner l'exigence de lignes clonales de poisson zèbre ou d'un hôte immunodéficié, un certain nombre de groupes ont utilisé des embryons de stade précoce ( c.-à-d. > 72 chOst-fertilisation (hpf)) pour la transplantation de cellules tumorales humaines, car ces embryons n'ont pas encore complètement développé un système immunitaire adaptatif 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . Cependant, ces méthodes sont limitées à l'analyse à court terme du comportement des cellules tumorales ou de la réponse au médicament (généralement moins de 2 semaines), car les cellules cancéreuses humaines ou la technique de transplantation elle-même tue l'hôte, empêchant les études à long terme et la ré-transplantation.
Ce protocole décrit une méthode de transplantation embryonnaire modifiée dans la lumière du quatrième ventricule d'un cerveau d'embryon de 2 jours après fertilisation (dpf). Il minimise la toxicité pour l'hôte et peut être combiné avec des modèles de tumeur cérébrale du poisson zèbre pour le greffe à long terme des cellules tumorales. Ainsi, cette technique alDes niveaux minimaux pour la ré-transplantation de cellules tumorales dans de nouveaux hôtes pendant de nombreuses générations, en facilitant de futures études sur l'hétérogénéité des tumeurs, les réponses immunitaires / immunitaires, les réponses aux médicaments ou le potentiel métastatique. Cette méthode est également simple, efficace et évolutive, car jusqu'à 300 transplantations peuvent être effectuées par un seul utilisateur par jour, avec jusqu'à 90% de greffe. Ceci permet la propagation rapide de tumeurs primaires individuelles en des centaines d'embryons à 2 dpf pour des projets de dépistage génétique ou de dépistage de drogue ou pour visualiser directement le comportement des cellules tumorales cérébrales dans différents milieux hôtes pendant de nombreux mois.
Ce protocole décrit un test de transplantation simple et efficace qui implique l'injection de cellules tumorales de poissons zèbres dans le ventricule d'un embryon de 2 dpf qui développera un système immunitaire entièrement compétent. Jusqu'à présent, le poisson zèbre CNS-PNET 17 et le mélanome (données non représentées) ont été transplantés avec succès pour des études à long terme sur le comportement des cellules tumorales et l'invasion. Les étapes critiques de ce protocole incluent la garantie de la taille appropriée de l'alourdissement de l'aiguille et de la suspension appropriée des cellules tumorales et des embryons hôtes d'anesthésiant adéquats. Pour chaque chercheur individuel, une meilleure optimisation de cette technique peut inclure l'ajustement de la concentration de cellules tumorales, de la pression d'injection et de l'orientation de l'embryon. En outre, il peut y avoir une hétérogénéité dans la viscosité des suspensions provenant de différentes tumeurs, de sorte que différents types de tumeurs peuvent être plus ou moins difficiles à ré-suspendre et à transplanter. Cependant, en ajustant la taille de l'alésage de l'aiguille et en utilisant difféDes dilutions de location de la suspension tumorale, il est possible de surmonter les difficultés associées aux viscosités tumorales.
Dans notre expérience, les raisons les plus courantes pour les cellules éparses / les masses cellulaires incohérentes dans le ventricule sont les suivantes: 1) la suspension de cellules tumorales est trop diluée; 2) la taille de l'aiguille est trop petite; 3) le temps d'injection et la pression sont trop faibles; Et / ou 4) les tissus restants n'ont pas été filtrés de la tumeur et sont logés dans l'aiguille. Lorsque la suspension de cellules tumorales sort du ventricule après injection, il est probablement dû à: 1) le placement de l'aiguille contre le plancher du ventricule; 2) une pression et un temps d'injection élevés; Et / ou 3) une taille d'alésage de l'aiguille trop grande. La faible survie des embryons transplantés peut être causée par: 1) l'anesthésie des embryons pendant une période prolongée; 2) laisser sécher les embryons sur la plaque d'injection; 3) l'injection de bulles d'air dans le ventricule; Et / ou 4) piercing organes vitaux, tels que le cerveau etCœur, parce que l'aiguille a traversé le ventricule.
Les méthodes antérieures de transplantation de tumeur dans le cerveau adulte ou embryonnaire du poisson zèbre dépendent de l'immunosuppression chez les adultes (génétiquement, pharmacologiquement ou par rayonnement) ou sont limitées à des études à court terme de cellules humaines ou de souris chez les embryons 38 , 43 , 52 , 53 , 54 . Par exemple, les tumeurs cérébrales de souris peuvent être injectées par voie intranasale dans du poisson zèbre juvénile juvénacé de dexaméthasone-immunodéprimé, 30-dpf, pour une utilisation dans des tests de médicaments précliniques à court terme (~ 2 jours) 54 . Cependant, le site d'injection dans ces expériences est obscurci par le crâne et le tissu cérébral et entraîne probablement des dommages aux tissus cérébrales normaux, ce qui réduit la viabilité de l'hôte et l'efficacité de la greffe. Une autre méthode récemment décrite implique l'injection de gliob humainLastoma dans la région du cerveau central des embryons de poissons zèbres, ce qui a permis l'analyse à court terme de la croissance, de l'invasion et de la réponse aux médicaments 43 . Encore une fois, la localisation précise du site d'injection est variable et endommage probablement les tissus normaux. Ainsi, les méthodes antérieures de transplantation embryonnaire de cerveau compromettent souvent la viabilité des hôtes, ce qui limite ces études à une analyse à court terme ( c.-à-d. De 2 à 14 jours), ce qui entraîne une variabilité accrue entre les injections individuelles en raison de sites d'injection obscurs, Analyse à long terme des comportements cellulaires et des réponses aux médicaments ou de la ré-transplantation à travers plusieurs générations.
La méthode décrite ici traite des limites actuelles des techniques embryonnaires de transplantation embryonnaire et de transplantation de poissons zèbres en permettant aux chercheurs de: 1) s'injecter de façon reproductible dans le même endroit, avec un dommage minimal sur le tissu environnant; 2) visualiser directement le site d'injection pour maximiserEfficacité de la greffe; 3) transplanter des centaines d'embryons par jour; 4) permettre aux tumeurs de pousser chez des animaux immunitaires; 5) permettent la surveillance du comportement des cellules tumorales et des réponses durables aux médicaments pendant la vie du poisson zèbre; Et 6) permettent la ré-transplantation de tumeurs pendant de nombreuses générations pour des études potentielles sur l'évolution tumorale ou les mécanismes de rechute de drogue. En outre, ce protocole permet aux chercheurs d'utiliser tout génotype de poisson zèbre pour l'évaluation de la réponse de l'hôte, y compris différentes populations immunitaires. Ces attributs rendent cette méthode facilement adaptable par tout laboratoire qui effectue déjà des micro-injections standard dans le poisson zèbre. Enfin, bien que cette méthode soit idéale pour les injections orthotopiques de tumeurs cérébrales de poissons zèbres, lors de la transplantation d'autres types de tumeurs, comme le foie ou le pancréas, le site orthotopique peut être plus important que la compétence immunitaire ( par exemple, si un chercheur étudie les effets du stromal Microenvironnement sur la croissance tumorale). Dans ce scénario, leLes modèles de poisson zèbre nouvellement développés et immunodéprimés peuvent être plus appropriés pour effectuer des transplantations de tumeur orthotopique 11 .
Ce protocole a été utilisé pour effectuer des tests de compétition de cellules tumorales et pour injecter des tumeurs à double étiquette. Une stratégie de traitement potentielle pour l'évaluation de l'efficacité des composés chimiques sur la tumorigénèse, qui implique le traitement des embryons post-transplantation par l'addition du médicament à l'eau, a également été discutée. Un procédé pour le traitement ex vivo de cellules tumorales avant la transplantation était également précédemment signalé 17 . En outre, les tumeurs transplantées ont été regroupées pour de multiples cycles de ré-transplantation, ce qui sera bénéfique pour les études d'évolution tumorale et de chimisistance 17 . Actuellement, les études précliniques dépendent de xénogreffes de souris pour évaluer l'efficacité des composés potentiels. Cependant, ces études prennent beaucoup de tempsEt coûteux. Compte tenu du degré élevé de conservation des voies de signalisation oncogénique entre le poisson zèbre et les humains 28 , on s'attend à ce que cette méthode viendra compléter les études classiques sur les cellules de souris et humaines pour permettre une identification plus rapide des composés efficaces dans les essais précliniques et cliniques. En fin de compte, cette méthode pourrait s'avérer utile pour le dépistage chimique rapide des tumeurs primaires des patients, ce qui pourrait propulser davantage l'initiative de médecine personnalisée. Cependant, les conditions de croissance à long terme des cellules humaines dans le poisson zèbre (adulte ou embryon) doivent encore être identifiées.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les deux réviseurs pour d'excellentes suggestions et améliorations au manuscrit. Nous remercions également Huntsman Cancer Institute / University of Utah pour l'élevage et la maintenance. Ce travail a été financé par l'American Cancer Society (# 124250-RSG-13-025-01-CSM), une subvention NIH (programme P30 CA042014 CRR), University of Utah Seed Grant et Huntsman Cancer Foundation.
Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
50 ml beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
1000 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
100 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
50 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
15 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
1.7 ml microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |