O transplante de células cancerosas é uma ferramenta importante para a identificação de mecanismos de câncer e respostas terapêuticas. As técnicas atuais dependem de animais imune-incompetentes. Descrevemos aqui um método para transplantar células tumorais de zebrafish em embriões imunocompetentes para a análise a longo prazo do comportamento de células tumorais e respostas de fármacos in vivo .
O transplante de células tumorais é uma técnica importante para definir os mecanismos que controlam o crescimento das células cancerígenas, a migração ea resposta do hospedeiro, bem como para avaliar a potencial resposta do paciente à terapia. Os métodos actuais dependem largamente da utilização de animais singeneicos ou imunocomprometidos para evitar a rejeição do enxerto tumoral. Tais m�odos requerem a utiliza�o de estirpes gen�icas espec�icas que muitas vezes impedem a an�ise de interac�es de c�ulas imuno-tumorais e / ou est� limitadas a antecedentes gen�icos espec�icos. Um método alternativo no peixe-zebra tira proveito de um sistema imunológico incompletamente desenvolvido no cérebro embrionário antes de 3 dias, onde as células tumorais são transplantadas para uso em ensaios de curto prazo ( isto é, 3 a 10 dias). No entanto, estes métodos causam a letalidade do hospedeiro, o que impede o estudo a longo prazo do comportamento das células tumorais e da resposta aos fármacos. Este protocolo descreve um método simples e eficiente para o transplante ortotópico a longo prazo de tecido de tumor cerebral de zebrafish emAo quarto ventrículo de um peixe-zebra imune-competente de 2 dias de idade. Este método permite: 1) estudo a longo prazo de comportamentos de células tumorais, tais como invasão e disseminação; 2) resposta duradoura do tumor às drogas; E 3) re-transplante de tumores para o estudo da evolução do tumor e / ou o impacto de diferentes fundos genéticos do hospedeiro. Em resumo, esta técnica permite que pesquisadores de câncer avaliem enxerto, invasão e crescimento em locais distantes, bem como para realizar análises químicas e testes de competição celular ao longo de muitos meses. Este protocolo pode ser alargado a estudos de outros tipos de tumores e pode ser utilizado para elucidar mecanismos de quimiorresistência e metástase.
O transplante de células tumorais em animais imunocomprometidos, particularmente xenoenxertos de ratinho, é uma técnica amplamente utilizada utilizada para estudar mecanismos que controlam a proliferação de células cancerígenas 1 , 2 , sobrevivência, invasão e metástase 3 , 4 , bem como para proporcionar uma plataforma Para rastreio de fármacos 5 , 6 , 7 . Mais recentemente, o transplante de amostras de tumor primário em ratinhos imunocomprometidos tem sido utilizado para gerar modelos de xenoenxertos (PDX) derivados de pacientes para fins de diagnóstico e pré-clínica de drogas e é a espinha dorsal da iniciativa de medicina personalizada 8 , 9 , 10 , 11 . Contudo, evidências significativas mostram que a modulação do sistema imunológicoTronco pode ter um impacto dramático no comportamento do tumor e no resultado do paciente 12,13 . Isto levou ao redesenho de técnicas baseadas em xenoenxerto para incluir ratinhos "humanizados", nos quais o sistema imunitário do ratinho é reconstituído por co-transplante de células imunitárias humanas com células tumorais. No entanto, essa abordagem ainda é tecnicamente desafiadora, com reprodutibilidade variável e toxicidades associadas à técnica, além do custo significativo 14,15. Assim, são necessárias novas técnicas de transplante em animais imunocompetentes para acelerar a descoberta de mecanismos específicos de tumores e de imunidade de progressão do cancro e resposta a fármacos.
Zebrafish são um modelo animal alternativo para o estudo do câncer humano, com mais de 20 modelos de câncer agora estabelecidos 16 , incluindo cérebro muito maligno 17 , mela Noma 18 , 19 , 20 , e cancros pancreáticos 21 , 22 , bem como muitas leucemias 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Dois atributos do sistema de peixe-zebra torná-lo particularmente adequado para a investigação do cancro: 1) a clareza óptica de animais translúcidos permite a visualização direta de comportamentos de células cancerígenas ( ie, proliferação, sobrevivência, invasão e disseminação) usando técnicas de microscopia simples e 2) O zebrafish fêmea pode produzir até 200 embriões por o dia, permitindo a escala rápida de números animais para a seleção genética ou da droga a um custo baixo. Além disso, os genomas de câncer de peixe-zebra e humanos são altamente conservados (incluindo oncogenes e genes supressores de tumor)Permitindo que as descobertas mecânicas e medicamentosas sejam rapidamente traduzidas em sistemas de mamíferos, o que torna o peixe-zebra um modelo animal ideal para técnicas de transplante, que se aproveitam da imagem, escalabilidade e baixo custo do sistema.
Estudos anteriores de transplante de tumores em zebrafish imunocomprometidos facilitaram a identificação de capacidades de auto-renovação, malignidade tumoral e invasão / disseminação 11 , 29 . Estudos a curto prazo do comportamento das células tumorais podem ser conduzidos após o transplante em adultos irradiados com y, cujos sistemas imunológicos são efetivamente suprimidos durante ~ 20 dias 11 , 30 . O tratamento de peixe-zebra adulto com dexametasona suprime as células B e T até 30 dias antes da rejeição 31 . Outra estratégia menos comum emprega estirpes clonal zebrafishQue permitem investigações a longo prazo em um hospedeiro imune-competente 32 . No entanto, apenas um número limitado de estirpes clonais foram geradas e são difíceis de manter devido à baixa fecundidade. Além disso, a maioria dos modelos de tumor zebrafish estabelecidos são gerados em outros antecedentes genéticos, por isso estes tumores não podem ser transplantados para as cepas clonais sem suprimir o sistema imunológico 11 , 33 , 34 . Abordagens mais recentes para melhorar os estudos de transplante a longo prazo incluem o desenvolvimento da linha mutante rag2 E450fs , com comprometimento das funções das células B e T, que tem sido utilizada para transplantar com sucesso vários tipos de câncer 35 , 36 . Para contornar a exigência de linhas de peixe-zebra clonal ou um hospedeiro imunocomprometido, vários grupos utilizaram embriões de fase inicial ( isto é, > 72 hpOst-fertilization (hpf)) para o transplante de células tumorais humanas, uma vez que estes embriões ainda não desenvolveram completamente um sistema imunológico adaptativo 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . No entanto, estes métodos limitam-se à análise a curto prazo do comportamento das células tumorais ou da resposta ao fármaco (normalmente menos de 2 semanas), porque as células de cancro humano ou a técnica de transplante própria mata o hospedeiro, prevenindo estudos a longo prazo e re-transplante.
Este protocolo detalha um método de transplante embrionário modificado para o lúmen do quarto ventrículo de um cérebro de embrião de 2 dias pós-adubação (dpf). Ele minimiza a toxicidade para o hospedeiro e pode ser combinado com zebrafish cérebro tumor modelos para o enxerto de longo prazo de células tumorais. Assim, esta técnica alBaixos para o re-transplante de células tumorais em novos hospedeiros ao longo de muitas gerações, facilitando futuros estudos sobre heterogeneidade tumoral, hospedeiro / respostas imunes, respostas a fármacos ou potencial metastático. Este método também é simples, eficiente e escalável, já que até 300 transplantes podem ser realizados por um único usuário por dia, com até 90% de enxerto. Isto permite a propagação rápida de tumores primários únicos em centenas de embriões a 2 dpf para projetos genéticos ou de rastreio de drogas ou para visualizar diretamente o comportamento de células tumorais cerebrais em diferentes origens de hospedeiro ao longo de muitos meses.
Este protocolo detalha um ensaio de transplante simples e eficiente que envolve a injeção de células tumorais de peixe-zebra no ventrículo de um embrião de 2 dpf que desenvolverá um sistema imunológico plenamente competente. Até agora, o peixe-zebra CNS-PNET 17 e o melanoma (dados não apresentados) foram transplantados com sucesso para estudos a longo prazo do comportamento e invasão de células tumorais. As etapas críticas deste protocolo incluem assegurar o tamanho apropriado do furo da agulha e a adequada suspensão de células tumorais e embriões hospedeiros adequadamente anestesiados. Para cada pesquisador individual, a optimização adicional desta técnica pode incluir o ajustamento da concentração de células tumorais, a pressão de injecção e a orientação do embrião. Além disso, pode haver heterogeneidade na viscosidade de suspensões originárias de diferentes tumores, pelo que diferentes tipos de tumores podem ser mais ou menos difíceis de re-suspender e transplantar. No entanto, ajustando o tamanho do furo da agulha e usandoAlugue as diluições da suspensão do tumor, é possível superar as dificuldades associadas com as viscosidades tumorais.
Em nossa experiência, as razões mais comuns para células esparsas / massas de células inconsistentes no ventrículo são as seguintes: 1) a suspensão de células tumorais é muito diluída; 2) o tamanho do furo da agulha é muito pequeno; 3) o tempo ea pressão da injeção são muito baixos; E / ou 4) tecido remanescente não foram filtrados a partir do tumor e são alojados na agulha. Quando a suspensão de células tumorais sai do ventrículo após a injecção, é provavelmente devido a: 1) a colocação da agulha contra o pavimento do ventrículo; 2) uma alta pressão e tempo de injeção; E / ou 3) um tamanho de furo da agulha que é demasiado grande. A baixa sobrevivência de embriões transplantados pode ser causada por: 1) embriões anestesiados por um longo período de tempo; 2) deixar os embriões na placa de injeção para secar; 3) a injecção de bolhas de ar no ventrículo; E / ou 4) órgãos vitais penetrantes, tais como o cérebro eCoração, porque a agulha passou pelo ventrículo.
Métodos anteriores de transplante de tumores no cérebro de zebrafish adulto ou embrionário dependem de imunossupressão em adultos (geneticamente, farmacologicamente ou via radiação) ou estão limitados a estudos a curto prazo de células humanas ou de ratinho em embriões 38 , 43 , 52 , 53 , 54 . Por exemplo, tumores cerebrais de ratinho podem ser injectados intranasalmente em dexametasona imunossuprimida, 30-dpf, peixe-zebra juvenil para utilização em ensaios de fármaco pré-clínicos a curto prazo (~ 2 dias) 54 . No entanto, o local de injecção nestes experimentos é obscurecido pelo crânio e tecido cerebral e provavelmente resulta em danos ao tecido cerebral normal, o que reduz a viabilidade do hospedeiro e a eficiência do enxerto. Outro método recentemente descrito envolve a injecção de gliob humanoLastoma na região do mesencéfalo de embriões de peixe-zebra, o que possibilitou a análise de curto prazo do crescimento, invasão e resposta às drogas 43 . Novamente, a localização precisa do local de injecção é variável e provoca danos no tecido normal. Assim, os métodos anteriores de transplante de cérebro embrionário muitas vezes comprometem a viabilidade dos hospedeiros, limitando estes estudos à análise de curto prazo ( isto é, 2 a 14 dias), causando maior variabilidade entre as injeções individuais devido a locais de injeção obscurecidos, Análise de longo prazo de comportamentos celulares e respostas de drogas ou de re-transplante através de várias gerações.
O método aqui descrito aborda as limitações atuais em técnicas de transplante embrionário e imunocomprometido do peixe-zebra, permitindo aos pesquisadores: 1) injetar reprodutivamente no mesmo local, com danos mínimos ao tecido circundante; 2) visualizar diretamente o local da injeção para maximizarEficácia do enxerto; 3) transplante centenas de embriões por dia; 4) permitem que os tumores cresçam em animais imunocompetentes; 5) permitem a monitorização do comportamento das células tumorais e respostas duradouras ao fármaco durante a vida do peixe-zebra; E 6) permitem o re-transplante de tumores ao longo de muitas gerações para estudos potenciais sobre a evolução tumoral ou mecanismos de recaída de fármaco. Além disso, este protocolo permite que os investigadores utilizem qualquer genótipo zebrafish para a avaliação da resposta do hospedeiro, incluindo diferentes populações imunes. Esses atributos tornam este método facilmente adaptável por qualquer laboratório que já executa microinjeções padrão em zebrafish. Finalmente, embora este método seja ideal para injeções ortotópicas de tumores cerebrais de peixe-zebra, quando transplantando outros tipos de tumores, como fígado ou pâncreas, o sítio ortotópico pode ser mais importante do que a competência imunológica ( por exemplo, se um pesquisador estiver estudando os efeitos do estroma Microambiente no crescimento tumoral). Neste cenário, oRecém-desenvolvido, imune deficientes zebrafish modelos podem ser mais adequados para a realização de transplantes de tumor ortotópico [ 11] .
Este protocolo tem sido utilizado para realizar ensaios de competição de células tumorais e para injectar tumores duplamente marcados. Foi também discutida uma potencial estratégia de tratamento para a avaliação da eficácia de compostos químicos na tumorigênese, que envolve o tratamento de embriões pós-transplante através da adição do fármaco à água. Um método para o tratamento ex vivo de células tumorais antes da transplantação também foi relatado anteriormente 17 . Adicionalmente, os tumores transplantados foram agrupados para várias rondas de re-transplante, o que será benéfico para estudos de evolução tumoral e quimiorresistência 17 . Actualmente, os estudos pré-clínicos dependem de xenoenxertos de ratinho para avaliar a eficácia de compostos potenciais. No entanto, esses estudos levam muito tempoE caro. Considerando o elevado grau de conservação das vias de sinalização oncogénicas entre o peixe-zebra e os seres humanos 28 , é de esperar que este método complementará estudos convencionais de células humanas e de ratinho para permitir a identificação mais rápida de compostos eficazes entrando em ensaios clínicos e pré-clínicos. Em última instância, este método poderia revelar-se útil para o rastreio químico rápido de tumores de pacientes primários, o que poderia impulsionar ainda mais a iniciativa de medicina personalizada. No entanto, as condições para o crescimento a longo prazo de células humanas em peixe-zebra (adulto ou embrião) ainda precisam ser identificados.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos aos dois revisores por excelentes sugestões e melhorias ao manuscrito. Agradecemos também Huntsman Cancer Institute / Universidade de Utah para a pecuária e manutenção. Este trabalho foi financiado pela American Cancer Society (# 124250-RSG-13-025-01-CSM), um NIH subvenção (P30 CA042014 CRR programa), a Universidade de Utah Seed Grant, e Huntsman Cancer Foundation.
Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
50 ml beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
1000 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
100 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
50 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
15 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
1.7 ml microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |