癌细胞的移植是识别癌症机制和治疗反应的重要工具。目前的技术取决于免疫力不足的动物。在这里,我们描述了一种将斑马鱼肿瘤细胞移植到免疫感受态胚胎中的方法,用于长期分析肿瘤细胞行为和体内药物反应。
肿瘤细胞移植是确定控制癌细胞生长,迁移和宿主反应的机制的重要技术,并评估潜在的患者治疗反应。目前的方法很大程度上取决于使用同基因或免疫受损的动物,以避免肿瘤移植物的排斥。这样的方法需要使用通常阻止免疫 – 肿瘤细胞相互作用分析和/或限于特定遗传背景的特定遗传菌株。斑马鱼的替代方法是在3天之前利用胚胎脑中不完全发育的免疫系统,其中移植肿瘤细胞用于短期测定( 即 3至10天)。然而,这些方法导致宿主致死性,这阻止了肿瘤细胞行为和药物反应的长期研究。该方案描述了长期原位移植斑马鱼脑肿瘤组织的简单有效的方法到2日龄免疫能力的斑马鱼的第四脑室。该方法允许:1)长期研究肿瘤细胞行为,如入侵和传播; 2)耐药性对药物的反应;和3)重新移植肿瘤用于研究肿瘤进展和/或不同宿主遗传背景的影响。总之,这项技术使癌症研究人员可以评估远端的移植,入侵和生长,以及在多个月内进行化学筛选和细胞竞争测定。该方案可扩展到其他肿瘤类型的研究,可用于阐明化疗耐药和转移的机制。
肿瘤细胞移植到免疫受损的动物,特别是小鼠异种移植物中,是一种广泛使用的技术,用于研究控制癌细胞增殖1,2 ,存活,侵袭和转移的机制3,4以及提供平台用于筛选药物5,6,7 。最近,将原发肿瘤样本移植到免疫受损的小鼠中已经被用于产生患者来源的异种移植(PDX)模型用于诊断和临床前药物筛选目的,并且是个性化医学计划的主体8,9,10,11 。然而,重要的证据表明调节免疫系统茎可以对肿瘤行为和患者结局产生重大影响12,13 。这推动了基于异种移植物技术的重新设计,包括“人源化”小鼠,其中通过将肿瘤细胞共同移植人免疫细胞来重建小鼠的免疫系统。然而,这种方法在技术上仍然具有挑战性,具有与该技术相关的可变重现性和毒性,除了显着的成本14,15 之外 。因此,需要免疫竞争动物的新型移植技术来加速发现癌症进展和药物反应的免疫和肿瘤特异性机制。
斑马鱼是人类癌症研究的替代动物模型,目前已有超过20种癌症模型建立了16种 ,其中包括高度恶性的脑17 ,mela神经18,19,20和胰腺癌21,22以及许多白血病23,24,25,26,27。斑马鱼系统的两个特征使其特别适合癌症研究:1)半透明动物的光学透明度允许使用简单的显微技术直接观察癌细胞行为( 即增殖,存活,侵袭和传播),以及2)女性斑马鱼每天可以产生多达200个胚胎,从而以低成本快速缩放动物数量进行遗传或药物筛选。此外,斑马鱼和人类的癌症基因组是高度保守的(包括致癌基因和肿瘤抑制基因)28“,让机械和药物发现迅速转化为哺乳动物系统,这些属性也使得斑马鱼成为移植技术的理想动物模型,可以利用系统的成像,可扩展性和低成本。
免疫损害斑马鱼的以前的肿瘤移植研究有助于鉴定自我更新能力,肿瘤恶性肿瘤和入侵/传播11,29。肿瘤细胞行为的短期研究可以在移植到γ-照射的成年人之后进行,其免疫系统被有效地抑制约20天11,30。成人斑马鱼与地塞米松的治疗在排斥发生前抑制B细胞和T细胞多达30天31 。另一个较不普遍的策略是使用克隆斑马鱼菌株这使得能够在免疫能力较强的宿主中长期进行调查32 。然而,只有有限数量的克隆菌株已经产生并且由于低繁殖力而难以维持。此外,大多数已建立的斑马鱼肿瘤模型是在其他遗传背景下产生的,因此这些肿瘤不能移植到克隆菌株中而不会抑制免疫系统11,33,34。改进长期移植研究的最新方法包括开发rag2 E450fs突变体系,具有受损的B细胞和T细胞功能,已被用于成功移植多种癌症35,36 。为了规避克隆斑马鱼系或免疫受损宿主的要求,许多组使用早期胚胎( 即 > 72马力受精(hpf))用于人类肿瘤细胞移植,因为这些胚胎尚未完全开发适应性免疫系统37,38,39,40,41,42,43。然而,这些方法仅限于对肿瘤细胞行为或药物反应的短期分析(通常少于2周),因为人类癌细胞或移植技术本身会杀死宿主,防止长期研究和再移植。
该方案详细描述了一种修复的胚胎移植方法进入受精2 d后胚胎脑的第四脑室的腔。它可以最大程度降低对宿主的毒性,并可与斑马鱼脑肿瘤模型结合,以长期植入肿瘤细胞。因此,这种技术肿瘤细胞重新移植到新的宿主多代中的低水平,有助于今后研究肿瘤异质性,宿主/免疫应答,药物反应或转移潜能。这种方法也是简单,高效和可扩展的,每天可以由单个用户执行多达300次移植,最多可以进行90%的移植。这允许单个原发性肿瘤在2 dpf的基因或药物筛选项目中快速繁殖到数百个胚胎,或者直接在不同的宿主背景下直观显现出脑肿瘤细胞行为。
该协议详细介绍了一种简单有效的移植测定方法,其涉及将斑马鱼肿瘤细胞注射到2-dpf胚胎的心室中,该胚胎将形成完全有效的免疫系统。到目前为止,斑马鱼CNS-PNET 17和黑素瘤(数据未显示)已成功移植,用于长期研究肿瘤细胞行为和侵袭。该方案的关键步骤包括确保适当的针孔尺寸和适当的肿瘤细胞悬浮液和充分麻醉宿主胚胎。对于每个研究人员,这种技术的进一步优化可能包括调整肿瘤细胞浓度,注射压力和胚胎取向。此外,源自不同肿瘤的悬浮液的粘度可能存在异质性,因此不同的肿瘤类型可能或多或少难以重新悬浮和移植。然而,通过调节针孔尺寸和使用diffe稀释肿瘤悬浮液,可以克服与肿瘤粘度相关的困难。
根据我们的经验,脑室稀疏细胞/细胞质量不一致的最常见原因如下:1)肿瘤细胞悬浮液太稀; 2)针孔尺寸太小; 3)注射时间和压力太低;和/或4)剩余的组织没有从肿瘤中过滤并且被放在针中。当肿瘤细胞悬浮液注射后流出脑室时,可能是由于:1)将针放置在心室的地板上; 2)高注射压力和时间;和/或3)过大的针孔尺寸。移植胚胎的低存活可能是由以下原因引起的:1)长时间麻醉胚胎; 2)将胚胎留在注射板上干燥; 3)将气泡注入脑室;和/或4)刺穿重要的器官,如大脑和心脏,因为针穿过心室。
成人或胚胎斑马鱼脑中以前的肿瘤移植方法依赖于成年人(遗传,药理学或经辐射)的免疫抑制,或仅限于在胚胎38,43,52,53,54中的人或小鼠细胞的短期研究。例如,小鼠脑肿瘤可以鼻内注射到地塞米松免疫抑制的30-dpf青少年斑马鱼中,用于短期(〜2天)临床前药物测定54 。然而,这些实验中的注射部位被颅骨和脑组织遮蔽,并可能导致对正常脑组织的损伤,这降低了宿主活力和植入效率。另一个最近描述的方法涉及注射人类gliob最终瘤细胞系进入斑马鱼胚胎的中脑区域,这使得能够对生长,入侵和药物反应进行短期分析43 。再次,注射部位的精确位置是可变的并且可能损害正常组织。因此,以前的胚胎脑移植方法通常会损害宿主的生存能力,将这些研究限于短期分析( 即 2至14天),导致由于注射部位模糊引起的单次注射之间的变异性增加,细胞行为和药物反应的长期分析或多代人的再移植。
这里描述的方法解决了斑马鱼胚胎和免疫受损的移植技术中的当前局限性,允许研究人员:1)可重复地注射到相同的位置,对周围组织的损伤最小; 2)直接可视化注射部位以最大化植入效率; 3)每天移植数百只胚胎; 4)允许肿瘤在免疫竞争动物中生长; 5)允许在斑马鱼的寿命期间监测肿瘤细胞行为和持久的药物反应;和6)允许肿瘤再次移植多代,用于肿瘤进展或药物复发机制的潜在研究。此外,该协议使研究人员能够利用任何斑马鱼基因型来评估宿主反应,包括不同的免疫群体。这些属性使得该方法可以容易地适应任何已经在斑马鱼中执行标准显微注射的实验室。最后,虽然这种方法对于斑马鱼脑肿瘤的原位注射是理想的,但当移植其他肿瘤类型(例如肝脏或胰腺)时,原位点可能比免疫能力更重要( 例如,如果研究人员正在研究基质的影响微环境对肿瘤生长)。在这种情况下,新开发的免疫缺陷斑马鱼模型可能更适合于进行原位肿瘤移植11 。
该方案已被用于进行肿瘤细胞竞争测定并注射双重标记的肿瘤。还讨论了用于评估化合物对肿瘤发生的有效性的潜在治疗策略,其涉及通过将药物添加到水中来移植后的胚胎的治疗。之前报道了移植前肿瘤细胞离体治疗的方法17 。另外,移植肿瘤已经合并进行多轮重新移植,这将有利于肿瘤进展和化学耐药性的研究17 。目前,临床前研究依赖于小鼠异种移植物来评估潜在化合物的功效。然而,这些研究是耗时的并且成本高昂。考虑到斑马鱼与人类之间的致癌信号通路的高度保守性28 ,预计这种方法将补充常规的小鼠和人类细胞研究,以便更快速地鉴定进入临床前和临床试验的有效化合物。最终,这种方法可以证明对于初级患者肿瘤的快速化学筛选是有用的,这可以进一步推动个性化医学计划。然而,斑马鱼(成人或胚胎)中人类细胞长期生长的条件仍然需要确定。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢两位审稿人对手稿的出色建议和改进。我们还感谢亨斯迈癌症研究所/犹他大学的畜牧和养护。这项工作由美国癌症协会(#124250-RSG-13-025-01-CSM),NIH补助金(P30 CA042014 CRR计划),犹他州大学种子基金会和亨斯曼癌症基金会资助。
Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
50 ml beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
1000 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
100 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
50 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
15 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
1.7 ml microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |