زرع الخلايا السرطانية هو أداة هامة لتحديد آليات السرطان والاستجابات العلاجية. تعتمد التقنيات الحالية على الحيوانات المناعية غير المؤهلة. هنا، ونحن تصف طريقة لزرع الخلايا السرطانية الزرد في الأجنة المختصة المناعة للتحليل على المدى الطويل من سلوك الخلايا السرطانية وفي ردود الفعل الجسم الحي المخدرات.
زرع الخلايا السرطانية هو تقنية هامة لتحديد آليات السيطرة على نمو الخلايا السرطانية، والهجرة، واستجابة المضيف، فضلا عن تقييم استجابة المريض المحتملة للعلاج. الطرق الحالية تعتمد إلى حد كبير على استخدام الحيوانات سينجينيك أو المناعة للخطر لتجنب رفض الكسب غير المشروع الورم. تتطلب هذه الأساليب استخدام سلالات وراثية محددة غالبا ما تمنع تحليل تفاعلات الخلايا المناعية للورم و / أو تقتصر على خلفيات وراثية محددة. طريقة بديلة في الزرد يستفيد من نظام المناعة غير مكتملة تماما في الدماغ الجنينية قبل 3 أيام، حيث يتم زرع الخلايا السرطانية لاستخدامها في المقايسات على المدى القصير ( أي 3-10 أيام). ومع ذلك، فإن هذه الأساليب تسبب الفتك المضيف، والذي يمنع دراسة طويلة الأجل لسلوك الخلايا السرطانية واستجابة المخدرات. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة لزرع مثلي الأجل على المدى الطويل من الأنسجة الورم الدماغ الزرد فيإلى البطين الرابع من الزرد المختصة المناعة المناعية 2 يوم. هذه الطريقة تسمح: 1) دراسة على المدى الطويل من السلوكيات الخلية السرطانية، مثل الغزو والنشر؛ 2) استجابة ورم دائم للمخدرات. و 3) إعادة زرع الأورام لدراسة تطور الورم و / أو تأثير مختلف الخلفيات الوراثية المضيفة. وباختصار، فإن هذه التقنية تسمح للباحثين السرطان لتقييم إنغرافتمنت، والغزو، والنمو في المواقع البعيدة، وكذلك لأداء شاشات الكيميائية والفحوصات المنافسة الخلية على مدى عدة أشهر. ويمكن تمديد هذا البروتوكول لدراسات أنواع الورم الأخرى، ويمكن استخدامها لتوضيح آليات المقاومة الكيميائية والانبثاث.
زرع الخلايا السرطانية في الحيوانات المناعية للخطر، وخاصة زينوغرافتس الماوس، هو تقنية تستخدم على نطاق واسع المستخدمة لدراسة آليات السيطرة على انتشار الخلايا السرطانية 1 ، 2 ، والبقاء على قيد الحياة، والغزو، ورم خبيث 3 ، 4 ، فضلا عن توفير منصة لفحص المخدرات 5 ، 6 ، 7 . في الآونة الأخيرة، تم استخدام زرع عينات الورم الأولية في الفئران المناعية للخطر لتوليد طعم أجنبي المستمدة من المريض (بدكس) نماذج لأغراض التشخيص والمخدرات قبل السريرية وفحص العمود الفقري لمبادرة الطب شخصية 8 و 9 و 10 و 11 . ومع ذلك، أدلة هامة تبين أن تحوير سي المناعةالجذعية يمكن أن يكون لها تأثير دراماتيكي على سلوك الورم ونتائج المريض 12 ، 13 . وقد أدى هذا إلى إعادة تصميم التقنيات القائمة على طعم أجنبي لتشمل الفئران "أنسنة"، حيث يتم إعادة تشكيل الجهاز المناعي للفأرة من خلال زرع خلايا المناعة البشرية مع الخلايا السرطانية. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا يزال من الناحية الفنية تحديا، مع متغير الاستنساخ والسمية المرتبطة بهذه التقنية، بالإضافة إلى تكلفة كبيرة 14 ، 15 . وبالتالي، هناك حاجة إلى تقنيات زرع جديدة في الحيوانات المناعية المختصة لتسريع اكتشاف آليات المناعة والورم محددة من تطور السرطان والاستجابة للمخدرات.
الزرد هي نموذج حيواني بديل لدراسة السرطان البشري، مع أكثر من 20 نماذج السرطان الآن إنشاء 16 ، بما في ذلك الدماغ الخبيث للغاية 17 ، ميلا نوما 18 ، 19 ، 20 ، وسرطان البنكرياس 21 ، 22 ، فضلا عن العديد من اللوكيميا 23 ، 24 ، 25 ، 26 ، 27 . اثنين من سمات نظام الزرد جعلها قابلة للتحديد خاصة لأبحاث السرطان: 1) الوضوح البصري للحيوانات شفافة يسمح للتصور المباشر للسلوك الخلايا السرطانية ( أي الانتشار والبقاء والغزو والنشر) باستخدام تقنيات المجهر بسيطة و 2) يمكن أن تنتج الزرد الإناث ما يصل إلى 200 الأجنة في اليوم الواحد، مما يسمح للالتسارع السريع لأرقام الحيوانات للفحص الجيني أو المخدرات بتكلفة منخفضة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم حفظ جينومات السرطان من الزرد والبشر للغاية (بما في ذلك الجينات الورمية والجينات الكابتة للورم)f "> 28، مما يتيح للاكتشافات الآلية والمخدرات أن تترجم بسرعة إلى نظم الثدييات، كما أن هذه الصفات تجعل الزرد نموذجا حيويا مثاليا لتقنيات الزرع، التي تستفيد من التصوير والتدرجية والتكلفة المنخفضة للنظام.
وقد سهلت الدراسات السابقة لزرع الورم في الزرد المناعي للخطر التعرف على قدرات التجديد الذاتي، ورم خبيث الورم، والغزو / نشر 11 ، 29 . ويمكن إجراء دراسات قصيرة الأجل لسلوك الخلايا السرطانية بعد زرع في البالغين المشع،، الذين يتم قمعها بشكل فعال أجهزة المناعة لمدة 20 يوما ~ 11 ، 30 . علاج الزرد الكبار مع ديكساميثازون يقمع B- والخلايا T لمدة تصل إلى 30 يوما قبل الرفض يحدث 31 . وهناك استراتيجية أخرى أقل شيوعا تستخدم سلالات الزرد نسيليالتي تمكن من تحقيقات طويلة الأجل في مضيف مختص مناعة 32 . ومع ذلك، لم يتم توليد سوى عدد محدود من سلالات نسلية وصعبة للحفاظ على بسبب انخفاض الخصوبة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إنشاء معظم النماذج الورم الزرد أنشئت في الخلفيات الوراثية الأخرى، لذلك لا يمكن زرع هذه الأورام في سلالات نسلي دون قمع الجهاز المناعي 11 ، 33 ، 34 . وتشمل الأساليب الحديثة لتحسين دراسات زرع طويلة الأجل تطوير خط متحولة Rag2 E450fs ، مع اختراق وظائف B- و T- الخلية، والتي تم استخدامها لنجاح زرع سرطان متعددة 35 ، 36 . للتحايل على متطلبات خطوط الزرد نسلي أو المضيف المناعي للخطر، استخدم عدد من المجموعات الأجنة في مرحلة مبكرة ( أي > 72 حصان(هف)) لزرع الخلايا السرطانية البشرية، حيث أن هذه الأجنة لم تتطور بشكل كامل على جهاز المناعة التكيف 37 ، 38 ، 39 ، 40 ، 41 ، 42 ، 43 . ومع ذلك، تقتصر هذه الطرق على تحليل قصير الأجل لسلوك الخلايا السرطانية أو الاستجابة للأدوية (عادة أقل من 2 أسابيع) لأن الخلايا السرطانية البشرية أو تقنية زرع نفسها تقتل المضيف، ومنع الدراسات طويلة الأجل وإعادة زرع.
هذا البروتوكول تفاصيل طريقة زرع الجنينية المعدلة في تجويف البطين الرابع من 2 يوم بعد الإخصاب (دبف) الدماغ الجنين. فإنه يقلل سمية إلى المضيف ويمكن الجمع بين نماذج الورم الدماغ الزرد ل إنغرافتمنت على المدى الطويل من الخلايا السرطانية. وهكذا، فإن هذه التقنية آلوانخفاض لإعادة زرع الخلايا السرطانية إلى مضيفات جديدة على مدى أجيال عديدة، وتسهيل الدراسات المستقبلية على عدم التجانس الورم، واستضافة المضيف / المناعة، واستجابات المخدرات، أو إمكانات النقيلي. هذا الأسلوب هو أيضا بسيطة وفعالة، وقابلة للتطوير، ما يصل إلى 300 زرع يمكن أن يؤديها مستخدم واحد في اليوم الواحد، مع ما يصل إلى 90٪ إنغرافتمنت. وهذا يسمح للانتشار السريع للأورام الأولية واحدة في مئات الأجنة في 2 دبف لمشاريع الفحص الجيني أو المخدرات أو لتصور مباشرة سلوك خلايا ورم الدماغ في الخلفيات المضيف المختلفة على مدى عدة أشهر.
هذا البروتوكول تفاصيل مقايسة زرع بسيطة وفعالة التي تنطوي على حقن خلايا الورم الزرد في البطين من الجنين 2-دبف التي من شأنها تطوير جهاز المناعة المختصة بكامل طاقتها. وحتى الآن، الزرد نس-بينت 17 وسرطان الجلد (البيانات لا يظهر) تم زرعها بنجاح لدراسات طويلة الأجل لسلوك الخلايا السرطانية والغزو. الخطوات الحاسمة من هذا البروتوكول تشمل ضمان إبرة مناسبة حجم تتحمل والسليم تعليق الخلايا السرطانية والأجنة تخدير المضيف بما فيه الكفاية. لكل باحث على حدة، مزيد من التحسين من هذه التقنية قد تشمل تعديل تركيز الخلايا السرطانية، ضغط الحقن، والتوجه الجنين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون هناك عدم التجانس في اللزوجة من تعليق الناشئة من الأورام المختلفة، لذلك أنواع ورم مختلفة قد يكون أكثر أو أقل صعوبة لإعادة تعليق وزرع. ومع ذلك، عن طريق ضبط حجم إبرة تتحمل واستخدام ديفالتخفيفات الإيجار من تعليق الورم، فمن الممكن للتغلب على الصعوبات المرتبطة لزوجة الورم.
في تجربتنا، والأسباب الأكثر شيوعا للخلايا متفرق / كتل الخلايا غير متناسقة في البطين هي كما يلي: 1) تعليق خلية الورم هو تمييع جدا. 2) إبرة تتحمل حجم صغير جدا. 3) وقت الحقن والضغط منخفضة جدا؛ و / أو 4) الأنسجة المتبقية لم تتم تصفيتها من الورم ويتم إيداعها في الإبرة. عندما يتدفق تعليق خلية الورم من البطين بعد الحقن، فمن المرجح بسبب: 1) وضع الإبرة ضد أرضية البطين. 2) ارتفاع ضغط الحقن والوقت؛ و / أو 3) إبرة تتحمل حجم كبير جدا. قد تكون ناجمة عن البقاء على قيد الحياة من الأجنة المزروعة: 1) الأجنة تخدير لفترة طويلة من الزمن. 2) ترك الأجنة على لوحة حقن لتجف. 3) حقن فقاعات الهواء في البطين. و / أو 4) ثقب الأعضاء الحيوية، مثل الدماغ والقلب، لأن إبرة ذهبت من خلال البطين.
الأساليب السابقة لزرع الورم في الدماغ الزرد أو الجنينية تعتمد على كبت المناعة في البالغين (وراثيا، صيدلانيا، أو عن طريق الإشعاع) أو تقتصر على الدراسات قصيرة الأجل من خلايا الإنسان أو الماوس في الأجنة 38 ، 43 ، 52 ، 53 ، 54 . على سبيل المثال، يمكن حقن أورام الدماغ الماوس داخل الأنف إلى ديكساميثازون مناعة، 30-دبف، الزرد الأحداث للاستخدام على المدى القصير (~ 2 أيام) فحوصات المخدرات قبل السريرية 54 . ومع ذلك، يتم حجب موقع الحقن في هذه التجارب من قبل أنسجة الجمجمة والدماغ، ومن المرجح أن يؤدي إلى تلف الأنسجة المخ الطبيعية، مما يقلل من جدوى المضيف والكفاءة إنغرافتمنت. طريقة أخرى وصفت مؤخرا ينطوي على حقن غليوب الإنسانخطوط الخلايا الماضومة في منطقة الدماغ المتوسط من الأجنة الزرد، مما مكن من تحليل على المدى القصير من النمو، والغزو، والاستجابة المخدرات 43 . مرة أخرى، الموقع الدقيق لموقع الحقن هو متغير ومن المرجح أن يضر الأنسجة العادية. وهكذا، فإن الأساليب السابقة لزرع الدماغ الجنينية غالبا ما تضر بقدرة المضيفين على البقاء، مما يحد من هذه الدراسات على التحليل القصير الأجل ( أي من يومين إلى 14 يوما)، مما يسبب زيادة في التباين بين الحقن الفردية بسبب مواقع الحقن المحجوبة، تحليل طويل الأجل للسلوكيات الخلوية واستجابات الأدوية أو إعادة زرع عبر أجيال متعددة.
الطريقة الموصوفة هنا يتناول القيود الحالية في الزرد الجنينية وتقنيات زرع المناعة للخطر عن طريق السماح للباحثين: 1) حقن بشكل متكاثر في نفس الموقع، مع الحد الأدنى من الأضرار التي لحقت الأنسجة المحيطة بها؛ 2) تصور مباشرة موقع الحقن لتعظيمكفاءة إنغرافتمنت؛ 3) زرع مئات من الأجنة يوميا. 4) تسمح الأورام أن تنمو في الحيوانات المناعية المختصة. 5) تسمح لرصد سلوك الخلايا السرطانية والاستجابات الدوائية دائمة على مدى حياة الزرد. و 6) تسمح لإعادة زرع الأورام على مدى أجيال عديدة للدراسات المحتملة على تطور الورم أو آليات الانتكاس المخدرات. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول يتيح للباحثين للاستفادة من أي النمط الجيني الزرد لتقييم استجابة المضيف، بما في ذلك السكان المناعي مختلفة. هذه السمات تجعل هذه الطريقة قابلة للتكيف بسهولة من قبل أي مختبر الذي يؤدي بالفعل ميكروينجكتيونس القياسية في الزرد. وأخيرا، في حين أن هذه الطريقة مثالية للحقن مثلي من أورام الدماغ الزرد، عند زرع أنواع الورم الأخرى، مثل الكبد أو البنكرياس، قد يكون موقع مثلي أكثر أهمية من الكفاءة المناعية (على سبيل المثال، إذا كان الباحث يدرس آثار انسجة المكروية على نمو الورم). في هذا السيناريو، ووضعت حديثا، ونماذج الزرد نقص المناعة قد يكون أكثر ملاءمة لأداء زرع الورم مثلي 11 .
وقد تم استخدام هذا البروتوكول لإجراء فحوصات المنافسة الخلايا السرطانية وحقن الأورام ذات العلامات المزدوجة. ونوقشت أيضا استراتيجية العلاج المحتملة لتقييم فعالية المركبات الكيميائية على الأورام، والذي ينطوي على علاج الأجنة بعد زرع عن طريق إضافة الدواء إلى الماء. كما تم الإبلاغ عن طريقة للعلاج خارج الجسم الحي من الخلايا السرطانية قبل زرع في وقت سابق 17 . بالإضافة إلى ذلك، تم تجميع الأورام المزروعة لعدة جولات من إعادة زرع، والتي سوف تكون مفيدة لدراسات تطور الورم والكيميائية 17 . حاليا، الدراسات ما قبل السريرية تعتمد على زينوغرافتس الماوس لتقييم فعالية المركبات المحتملة. ومع ذلك، فإن هذه الدراسات تستغرق وقتا طويلاومكلفة. وبالنظر إلى درجة عالية من الحفاظ على مسارات الجين المسرطنة بين الزرد والبشر 28 ، فمن المتوقع أن هذا الأسلوب سوف تكمل الفأر التقليدية ودراسات الخلايا البشرية للسماح لتحديد أكثر سرعة من المركبات الفعالة دخول التجارب السريرية والسريرية. في نهاية المطاف، يمكن لهذه الطريقة أن تكون مفيدة للفحص الكيميائي السريع للأورام المريض الأولية، والتي يمكن أن تدفع إلى دفع مبادرة الطب شخصية. ومع ذلك، فإن الظروف للنمو على المدى الطويل من الخلايا البشرية في الزرد (الكبار أو الجنين) لا تزال بحاجة إلى تحديدها.
The authors have nothing to disclose.
نشكر اثنين من المراجعين لاقتراحات وتحسينات ممتازة للمخطوطة. كما نشكر معهد هانتسمان للسرطان / جامعة يوتا لتربية الحيوانات والصيانة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الجمعية الأمريكية للسرطان (# 124250- رسغ-13-025-01-كسم)، ومنحة المعاهد الوطنية للصحة (P30 CA042014 كر)، وجامعة يوتا البذور منحة، ومؤسسة السرطان هنتسمان.
Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
50 ml beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
1000 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
100 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
50 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
15 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
1.7 ml microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |