El trasplante de células cancerosas es una herramienta importante para la identificación de mecanismos de cáncer y respuestas terapéuticas. Las técnicas actuales dependen de animales inmuno-incompetentes. En este artículo, describimos un método para trasplantar células tumorales de pez cebra en embriones inmune-competentes para el análisis a largo plazo del comportamiento de las células tumorales y las respuestas in vivo a los fármacos.
El trasplante de células tumorales es una técnica importante para definir los mecanismos que controlan el crecimiento de las células cancerosas, la migración y la respuesta del huésped, así como para evaluar la respuesta potencial del paciente a la terapia. Los métodos actuales dependen en gran medida del uso de animales singénicos o inmunocomprometidos para evitar el rechazo del injerto tumoral. Tales métodos requieren el uso de cepas genéticas específicas que a menudo impiden el análisis de interacciones de células inmunitarias y / o se limitan a antecedentes genéticos específicos. Un método alternativo en el pez cebra se aprovecha de un sistema inmunológico incompleto desarrollado en el cerebro embrionario antes de 3 días, donde las células tumorales se trasplantan para su uso en ensayos a corto plazo ( es decir, de 3 a 10 días). Sin embargo, estos métodos causan letalidad del hospedador, lo que impide el estudio a largo plazo del comportamiento de las células tumorales y la respuesta de fármacos. Este protocolo describe un método simple y eficiente para el trasplante ortotópico a largo plazo de tejido cerebral de cerebro de pez cebra enAl cuarto ventrículo de un pez cebra inmune-competente de 2 días de edad. Este método permite: 1) el estudio a largo plazo de las conductas de las células tumorales, como la invasión y la diseminación; 2) respuesta duradera del tumor a los fármacos; Y 3) retrasplante de tumores para el estudio de la evolución tumoral y / o el impacto de diferentes fondos genéticos del huésped. En resumen, esta técnica permite a los investigadores del cáncer evaluar el injerto, la invasión y el crecimiento en sitios distantes, así como realizar pruebas químicas y ensayos de competición celular durante muchos meses. Este protocolo se puede extender a estudios de otros tipos de tumores y puede usarse para elucidar mecanismos de quimiorresistencia y metástasis.
El trasplante de células tumorales en animales inmunocomprometidos, en particular los xenoinjertos de ratón, es una técnica ampliamente utilizada utilizada para estudiar mecanismos que controlan la proliferación de células cancerígenas 1 , 2 , supervivencia, invasión y metástasis 3 , 4 , ası como proporcionar una plataforma Para el cribado de fármacos 5 , 6 , 7 . Más recientemente, se ha utilizado el trasplante de muestras de tumores primarios en ratones inmunocomprometidos para generar modelos de xenoinjerto (PDX) derivados de pacientes para fines de diagnóstico y preclínicos de detección de fármacos y es la columna vertebral de la iniciativa de medicina personalizada 8 , 9 , 10 , 11 . Sin embargo, evidencia significativa demuestra que la modulación de la inmunidad syTallo puede tener un impacto dramático en el comportamiento del tumor y el resultado del paciente [ 12 , 13] . Esto ha impulsado el rediseño de técnicas basadas en xenoinjertos para incluir ratones "humanizados", en los que el sistema inmune del ratón se reconstituye mediante el co-trasplante de células inmunes humanas con células tumorales. Sin embargo, este enfoque sigue siendo técnicamente desafiante, con reproducibilidad variable y toxicidades asociadas con la técnica, además del costo significativo 14 , 15 . Por lo tanto, se necesitan nuevas técnicas de trasplante en animales inmunocompetentes para acelerar el descubrimiento de mecanismos específicos del tumor y de la inmunidad de la progresión del cáncer y la respuesta del fármaco.
El pez cebra es un modelo animal alternativo para el estudio del cáncer humano, con más de 20 modelos de cáncer ahora establecidos 16 , incluyendo el cerebro muy maligno 17 , mela Noma 18 , 19 , 20 y cánceres pancreáticos 21 , 22 , así como muchas leucemias 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Dos atributos del sistema de pez cebra lo hacen especialmente adecuado para la investigación del cáncer: 1) la claridad óptica de los animales translúcidos permite la visualización directa de las conductas de las células cancerosas ( es decir, la proliferación, la supervivencia, la invasión y la diseminación) El pez cebra femenino puede producir hasta 200 embriones por día, lo que permite el rápido escalamiento de los números de animales para la detección genética o de drogas a un bajo costo. Además, los genomas de cáncer de pez cebra y humanos son altamente conservados (incluyendo oncogenes y genes supresores de tumores)F "> 28, permitiendo que los descubrimientos mecánicos y de fármacos se traduzcan rápidamente a sistemas de mamíferos, lo que hace que el pez cebra sea un modelo animal ideal para técnicas de trasplante que aprovechan la imagen, escalabilidad y bajo costo del sistema.
Estudios previos de trasplante de tumores en el pez cebra con compromiso inmunológico han facilitado la identificación de capacidades de auto-renovación, malignidad tumoral e invasión / diseminación 11 , 29 . Los estudios a corto plazo del comportamiento de las células tumorales pueden realizarse tras el trasplante en adultos irradiados con γ, cuyos sistemas inmunológicos se suprimen eficazmente durante ~ 20 días [ 11 , 30] . El tratamiento del pez cebra adulto con dexametasona suprime las células B y T durante hasta 30 días antes de que se produzca el rechazo 31 . Otra estrategia menos común emplea clonal cebra cepasQue permiten investigaciones a largo plazo en un huésped inmune-competente 32 . Sin embargo, sólo se ha generado un número limitado de cepas clonales y son difíciles de mantener debido a su baja fecundidad. Además, la mayoría de los modelos establecidos tumor de pez cebra se generan en otros antecedentes genéticos, por lo que estos tumores no pueden ser trasplantados en las cepas clonales sin suprimir el sistema inmunológico [ 11 , 33 , 34] . Los enfoques más recientes para mejorar los estudios de transplante a largo plazo incluyen el desarrollo de la línea mutante rag2 E450fs , con funciones B y T comprometidas, que se ha utilizado para trasplantar con éxito varios tipos de cáncer 35 , 36 . Para eludir el requisito de las líneas clonales de pez cebra o un huésped inmunocomprometido, varios grupos han utilizado embriones en etapa temprana ( es decir, > 72 CVOst-fertilization (hpf)) para el trasplante de células tumorales humanas, ya que estos embriones aún no han desarrollado completamente un sistema inmune adaptativo 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . Sin embargo, estos métodos se limitan al análisis a corto plazo del comportamiento de las células tumorales o la respuesta a fármacos (usualmente menos de 2 semanas) debido a que las células cancerosas humanas o la técnica de trasplante por sí misma matan al huésped, evitando estudios a largo plazo y retrasplante.
Este protocolo detalla un método de trasplante embrionario modificado en el lumen del cuarto ventrículo de un cerebro de embrión de 2 días después de la fecundación (dpf). Minimiza la toxicidad para el huésped y puede combinarse con modelos de tumor cerebral de pez cebra para el injerto a largo plazo de células tumorales. Así, esta técnica alBajos para el re-transplante de células tumorales en nuevos huéspedes durante muchas generaciones, lo que facilita estudios futuros sobre la heterogeneidad tumoral, respuestas huésped / inmune, respuestas a fármacos o potencial metastásico. Este método también es simple, eficiente y escalable, ya que hasta 300 trasplantes pueden ser realizados por un solo usuario por día, con hasta 90% de injerto. Esto permite la propagación rápida de tumores primarios individuales en cientos de embriones a 2 dpf para proyectos genéticos o de detección de fármacos o para visualizar directamente el comportamiento de células tumorales cerebrales en diferentes fondos de acogida durante muchos meses.
Este protocolo detalla un ensayo de trasplante simple y eficiente que implica la inyección de células tumorales de pez cebra en el ventrículo de un embrión de 2 dpf que desarrollará un sistema inmune plenamente competente. Hasta el momento, el pez cebra CNS-PNET 17 y el melanoma (datos no mostrados) han sido trasplantados con éxito para estudios a largo plazo del comportamiento de las células tumorales y la invasión. Los pasos críticos de este protocolo incluyen asegurar el tamaño apropiado del agujero de la aguja y la suspensión adecuada de células tumorales y embriones huésped adecuadamente anestesiantes. Para cada investigador individual, la optimización adicional de esta técnica puede incluir el ajuste de la concentración de células tumorales, la presión de inyección y la orientación del embrión. Además, puede haber heterogeneidad en la viscosidad de las suspensiones originarias de diferentes tumores, por lo que diferentes tipos de tumores pueden ser más o menos difíciles de volver a suspender y trasplantar. Sin embargo, ajustando el diámetro de la aguja y utilizandoAlquil diluciones de la suspensión del tumor, es posible superar las dificultades asociadas con las viscosidades tumorales.
En nuestra experiencia, las razones más comunes para células escasas / masas de células inconsistentes en el ventrículo son las siguientes: 1) la suspensión de células tumorales es demasiado diluido; 2) el diámetro de la aguja es demasiado pequeño; 3) el tiempo y la presión de inyección son demasiado bajos; Y / o 4) el tejido restante no se filtró del tumor y se aloja en la aguja. Cuando la suspensión de células tumorales sale del ventrículo después de la inyección, es probablemente debido a: 1) la colocación de la aguja contra el suelo del ventrículo; 2) una alta presión y tiempo de inyección; Y / o 3) un diámetro de aguja demasiado grande. La baja supervivencia de los embriones trasplantados puede ser causada por: 1) embriones anestesiados durante un período de tiempo prolongado; 2) dejar secar los embriones en la placa de inyección; 3) la inyección de burbujas de aire en el ventrículo; Y / o 4) piercing órganos vitales, como el cerebro yCorazón, porque la aguja pasó por el ventrículo.
Los métodos anteriores de trasplante de tumores en el cerebro de pez cebra adulto o embrionario dependen de la inmunosupresión en adultos (genéticamente, farmacológicamente o vía radiación) o se limitan a estudios a corto plazo de células humanas o de ratón en embriones 38 , 43 , 52 , 53 , 54 . Por ejemplo, los tumores cerebrales de ratón se pueden inyectar intranasalmente en dexametasona-inmunosuprimido, 30-dpf, pez cebra juvenil para su uso en corto plazo (~ 2 días) los ensayos de fármacos preclínicos [ 54] . Sin embargo, el sitio de inyección en estos experimentos es obscurecido por el cráneo y el tejido cerebral y probablemente da lugar a daño al tejido cerebral normal, lo que reduce la viabilidad del huésped y la eficacia del injerto. Otro método descrito recientemente implica la inyección de gliob humanoLastoma en la región del cerebro medio de los embriones de pez cebra, lo que permitió el análisis a corto plazo del crecimiento, la invasión y la respuesta de fármacos [ 43] . De nuevo, la localización precisa del sitio de inyección es variable y probablemente daña el tejido normal. Por lo tanto, los métodos previos de trasplante de cerebro embrionario comprometen a menudo la viabilidad de los huéspedes, limitando estos estudios a un análisis a corto plazo ( es decir, 2 a 14 días), causando una mayor variabilidad entre las inyecciones individuales debido a sitios de inyección oscurecidos, A largo plazo de los comportamientos celulares y de las respuestas a los fármacos o de re-trasplante a través de múltiples generaciones.
El método descrito aquí se refiere a las limitaciones actuales en las técnicas de trasplante embrionario e inmunocompuesto de pez cebra, permitiendo a los investigadores: 1) inyectar reproduciblemente en el mismo lugar, con un daño mínimo al tejido circundante; 2) visualizar directamente el sitio de inyección para maximizarEficacia del injerto; 3) trasplantar cientos de embriones por día; 4) permitir que los tumores crezcan en animales inmunes a la competencia; 5) permitir el seguimiento del comportamiento de las células tumorales y las respuestas duraderas de fármacos durante la vida del pez cebra; Y 6) permiten el re-transplante de tumores durante muchas generaciones para estudios potenciales sobre la evolución tumoral o mecanismos de recaída de fármacos. Además, este protocolo permite a los investigadores utilizar cualquier genotipo de pez cebra para la evaluación de la respuesta del huésped, incluyendo diferentes poblaciones inmunes. Estos atributos hacen que este método sea fácilmente adaptable por cualquier laboratorio que ya realiza microinyecciones estándar en el pez cebra. Por último, si bien este método es ideal para las inyecciones ortotópicas de tumores cerebrales de pez cebra, al trasplantar otros tipos de tumores, como el hígado o el páncreas, el sitio ortotópico puede ser más importante que la competencia inmunológica ( por ejemplo, si un investigador está estudiando los efectos del estroma Microambiente en el crecimiento tumoral). En este escenario, laRecientemente desarrollados, los modelos de peces cebra con deficiencia inmunitaria pueden ser más apropiados para realizar trasplantes de tumores ortotópicos [ 11] .
Este protocolo se ha utilizado para realizar ensayos de competición de células tumorales e inyectar tumores marcados doblemente. También se discutió una estrategia de tratamiento potencial para la evaluación de la efectividad de compuestos químicos en la tumorigénesis, que implica el tratamiento de embriones post-trasplante mediante la adición del fármaco al agua. También se informó previamente de un método para el tratamiento ex vivo de células tumorales antes del trasplante 17 . Además, los tumores trasplantados se han agrupado para múltiples rondas de re-transplante, que será beneficioso para los estudios de evolución tumoral y quimiorresistencia [ 17] . Actualmente, los estudios preclínicos dependen de los xenoinjertos de ratón para evaluar la eficacia de los compuestos potenciales. Sin embargo, estos estudios consumen mucho tiempoY costoso. Teniendo en cuenta el alto grado de conservación de las vías de señalización oncogénicas entre el pez cebra y los seres humanos [ 28] , es de esperar que este método complementará estudios convencionales de células de ratón y humanos para permitir la identificación más rápida de compuestos eficaces entrando preclínicos y ensayos clínicos. En última instancia, este método podría resultar útil para la detección química rápida de los tumores de pacientes primarios, lo que podría impulsar aún más la iniciativa de la medicina personalizada. Sin embargo, las condiciones para el crecimiento a largo plazo de las células humanas en el pez cebra (adulto o embrión) todavía necesitan ser identificados.
The authors have nothing to disclose.
Damos las gracias a los dos revisores por excelentes sugerencias y mejoras al manuscrito. También agradecemos Huntsman Cancer Institute / Universidad de Utah por la cría de animales y mantenimiento. Este trabajo fue financiado por la Sociedad Americana del Cáncer (# 124250-RSG-13-025-01-CSM), una subvención NIH (P30 CA042014 programa CRR), la Universidad de Utah Seed Grant y la Huntsman Cancer Foundation.
Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
50 ml beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
1000 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
100 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
50 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
15 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
1.7 ml microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |