De transplantatie van kankercellen is een belangrijk instrument voor de identificatie van kankermechanismen en therapeutische reacties. Huidige technieken zijn afhankelijk van immuun-incompetente dieren. Hier beschrijven we een methode om zebravis tumorcellen te transplanteren in immuun-competente embryo's voor de langetermijnanalyse van tumorcelgedrag en in vivo drugresponsen.
Tumorceltransplantatie is een belangrijke techniek om de mechanismen te bepalen die kankercelgroei, migratie en gastrespons bepalen, evenals potentiële patiëntenrespons op de therapie beoordelen. Huidige methoden zijn grotendeels afhankelijk van het gebruik van syngeneen- of immuun-gecompromitteerde dieren om afwijzing van het tumorgraft te vermijden. Dergelijke methoden vereisen het gebruik van specifieke genetische stammen die vaak de analyse van immuun-tumorcelinteracties voorkomen en / of zijn beperkt tot specifieke genetische achtergronden. Een alternatieve methode bij zebravis maakt gebruik van een onvoltooid ontwikkeld immuunsysteem in de embryonale hersenen voor 3 dagen, waarbij tumorcellen worden getransplanteerd voor gebruik bij korte analyses ( dwz 3 tot 10 dagen). Deze methoden veroorzaken echter gastvrijheid, die de langetermijnstudie van tumorcelgedrag en drugrespons voorkomt. Dit protocol beschrijft een eenvoudige en efficiënte methode voor de langdurige orthotopische transplantatie van zebravis hersentumorweefsel inNaar de vierde ventrikel van een 2-daagse immuun-competente zebravis. Deze methode maakt het mogelijk om: 1) langdurige studie van tumorcelgedrag, zoals invasie en verspreiding; 2) duurzaam tumorrespons op drugs; En 3) re-transplantatie van tumoren voor de studie van tumor evolutie en / of de impact van verschillende gastheergenetische achtergronden. Kortom, deze techniek stelt kankeronderzoekers in staat om engraftment, invasie en groei op afgelegen plaatsen te beoordelen, evenals chemische schermen en celcompetitieonderzoeken gedurende vele maanden. Dit protocol kan uitgebreid worden naar studies van andere tumortypen en kunnen gebruikt worden om mechanismen van chemoresistentie en metastase te verhelderen.
De transplantatie van tumorcellen in immuun-gecompromitteerde dieren, in het bijzonder muis xenografen, is een veelgebruikte techniek die wordt gebruikt om mechanismen te bestuderen die kankercelsproliferatie 1 , 2 , overleving, invasie en metastase 3 , 4 bestrijden en een platform bieden Voor het screenen van drugs 5 , 6 , 7 . Meer recent is de transplantatie van primaire tumormonsters in immuun-gecompromitteerde muizen gebruikt om patiëntgerelateerde xenograftmodellen (PDX) te genereren voor diagnostische en preklinische drugscreeningsdoeleinden en is de ruggengraat van het gepersonaliseerde medicijninitiatief 8 , 9 , 10 , 11 . Echter, significante bewijzen blijkt dat het moduleren van het immuunsysteemStam kan een dramatische invloed hebben op tumorgedrag en patiëntuitkomst 12 , 13 . Dit heeft de herontwerp van xenograft-gebaseerde technieken aangedreven om "gehumaniseerde" muizen te omvatten, waarin het immuunsysteem van de muis wordt gereconstitueerd door co-transplantatie van menselijke immuuncellen met tumorcellen. Deze aanpak is echter technisch uitdagend, met variabele reproduceerbaarheid en toxiciteiten die verband houden met de techniek, naast de significante kosten 14 , 15 . Zo zijn nieuwe transplantatietechnieken in immuunvaardige dieren nodig om de ontdekking van immuun- en tumor-specifieke mechanismen van kankerprogressie en drugrespons te versnellen.
Zebravis zijn een alternatief diermodel voor de studie van menselijke kanker, met meer dan 20 kankermodellen die nu 16 zijn , waaronder zeer kwaadaardige hersenen 17 , mela Noma 18 , 19 , 20 en pancreaskanker 21 , 22 , evenals veel leukemieën 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Twee eigenschappen van het zebravissysteem maken het bijzonder vatbaar voor kankeronderzoek: 1) de optische helderheid van doorschijnende dieren zorgt voor een directe visualisatie van kankercelgedrag ( dwz proliferatie, overleving, invasie en verspreiding) met behulp van eenvoudige microscopietheorieën en 2) Vrouwelijke zebravis kan tot 200 embryo's per dag produceren, waardoor de dierencijfers snel worden verlaagd voor genetische of drugscreening tegen lage kosten. Daarnaast zijn de kankergenomen van zebravis en mensen sterk bewaard (waaronder oncogenes en tumor-suppressorgenen)F "> 28, waardoor mechanistische en drug ontdekkingen snel vertaald kunnen worden naar zoogdier systemen. Deze eigenschappen maken ook de zebravis een ideaal diermodel voor transplantatietechnieken, die gebruik maken van de beeldvorming, schaalbaarheid en lage kosten van het systeem.
Vorige onderzoeken over tumortransplantatie bij immuun-gecompromitteerde zebravis hebben de identificatie van zelfvernieuwende vermogens, tumor maligniteit en invasie / verspreiding 11 , 29 vergemakkelijkt. Korte termijn studies van tumorcel gedrag kunnen worden uitgevoerd na transplantatie in γ-bestraalde volwassenen, wier immuunsysteem effectief wordt onderdrukt voor ~ 20 dagen 11 , 30 . De behandeling van volwassen zebravis met dexamethason vermindert B- en T-cellen gedurende maximaal 30 dagen voordat de afwijzing plaatsvindt 31 . Een andere minder voorkomende strategie maakt gebruik van clonale zebravisstammenDie langdurige onderzoeken mogelijk maken in een immuuncompetente gastheer 32 . Echter, slechts een beperkt aantal clonale stammen zijn gegenereerd en zijn moeilijk te handhaven door lage fecunditeit. Daarnaast worden de meeste van de gevestigde zebravistumormodellen gegenereerd in andere genetische achtergronden, zodat deze tumoren niet in de klonistammen kunnen worden getransplanteerd zonder het immuunsysteem 11 , 33 , 34 te onderdrukken. Meer recente benaderingen om transplantatieonderzoeken te verbeteren, zijn onder meer de ontwikkeling van de mutagene lijn van rag2 E450fs , met gecompromitteerde B- en T-celfuncties, die gebruikt zijn om succesvol meerdere kankers 35 , 36 te transplanteren. Om de eis van clonale zebravislijnen of een immuungemeneerde gastheer te omzeilen, hebben een aantal groepen vroege embryo's gebruikt ( dwz > 72 pkOste-bevruchting (hpf)) voor humane tumorceltransplantatie, aangezien deze embryo's nog niet een adaptief immuunsysteem 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 volledig hebben ontwikkeld. Deze methoden zijn echter beperkt tot de korte termijn analyse van tumorcelgedrag of drugrespons (meestal minder dan 2 weken) omdat de menselijke kankercellen of de transplantatietechniek zelf de gastheer doden, langetermijnstudies en hertransplantatie voorkomen.
Dit protocol beschrijft een gewijzigde embryonale transplantatie methode in het lumen van de vierde ventrikel van een 2-dagen post-fertilisatie (dpf) embryo hersenen. Het minimaliseert toxiciteit aan de gastheer en kan gecombineerd worden met zebravis hersentumormodellen voor de langetermijngroepering van tumorcellen. Aldus, deze techniek alLaagtepunten voor de hertransplantatie van tumorcellen in nieuwe gastheren over vele generaties, waardoor toekomstige studies over tumor heterogeniteit, gastheer / immuunrespons, drugrespons of metastatisch potentieel worden vergemakkelijkt. Deze methode is ook eenvoudig, efficiënt en schaalbaar, aangezien maximaal 300 transplantaties kunnen worden uitgevoerd door een enkele gebruiker per dag, met maximaal 90% engraftment. Dit zorgt voor de snelle voortplanting van enkele primaire tumoren in honderden embryo's bij 2 dpf voor genetische of drugscreeningsprojecten of om het gedrag van hersentumorcel in verschillende gastachtergronden over meerdere maanden direct te visualiseren.
Dit protocol beschrijft een eenvoudige en efficiënte transplantatie-analyse die de injectie van zebravistumoren in de hartslag van een 2-dpf-embryo omvat die een volledig bevochtig immuunsysteem zal ontwikkelen. Tot nu toe zijn zebravis CNS-PNET 17 en melanoom (data niet getoond) succesvol getransplanteerd voor langetermijnstudies van tumorcelgedrag en invasie. De kritische stappen van dit protocol omvatten het waarborgen van de juiste naaldboorgrootte en de juiste tumorcel-suspensie en adequaat verdoving van gastheerembryo's. Voor elke individuele onderzoeker kan verdere optimalisatie van deze techniek de aanpassing van de tumorcelconcentratie, injectiedruk en embryo-oriëntatie omvatten. Bovendien kan er heterogeniteit zijn in de viscositeit van suspensies die afkomstig zijn van verschillende tumoren, zodat verschillende tumortypen nauwelijks moeilijk kunnen worden opschort en transplanteren. Door echter de naaldboorgrootte aan te passen en diffe te gebruikenHuurverdunningen van de tumor suspensie, het is mogelijk om problemen die verband houden met tumorviscositeiten te overwinnen.
In onze ervaring zijn de meest voorkomende redenen voor dunne cellen / inconsistente celmassa's in de ventrikel als volgt: 1) de tumorcel suspensie is te verdund; 2) de naaldboorgrootte is te klein; 3) de injectietijd en de druk zijn te laag; En / of 4) overgebleven weefsel werden niet van de tumor gefiltreerd en in de naald geplaatst. Wanneer de tumorcel suspensie na de injectie uit de ventrikel loopt, is het waarschijnlijk het gevolg van: 1) de plaatsing van de naald tegen de vloer van de ventrikel; 2) een hoge injectiedruk en tijd; En / of 3) een te grote boorgrootte. Lage overleving van getransplanteerde embryo's kan worden veroorzaakt door: 1) verdovende embryo's gedurende een langere periode; 2) het verlaten van embryo's op de injectieplaat om te drogen; 3) de injectie van luchtbellen in de ventrikel; En / of 4) piercing vitale organen, zoals de hersenen enHart, omdat de naald door de ventrikel ging.
Eerdere methoden van tumortransplantatie in de volwassen of embryonale zebravisbrein zijn afhankelijk van immunosuppressie bij volwassenen (genetisch, farmacologisch of via straling) of zijn beperkt tot korte termijn studies van menselijke of muiscellen in embryo's 38 , 43 , 52 , 53 , 54 . Bijvoorbeeld, muishersen tumoren kunnen intranasaal worden geïnjecteerd in dexamethason-immuun-onderdrukte, 30-dpf, jeugdige zebravissen voor gebruik in korte termijn (~ 2 dagen) preklinische geneesmiddelanalyses 54 . De injectieplaats in deze experimenten wordt echter door de schedel- en hersenweefsel verduisterd en resulteert waarschijnlijk in schade aan normaal hersenweefsel, waardoor de levensvatbaarheid van de gastheer en de ingrijpingsefficiëntie wordt verminderd. Een andere recent beschreven werkwijze omvat de injectie van menselijke gliobLastoma cellijnen in de midbrain regio van zebravis embryo's, waardoor de korte termijn analyse van groei, invasie en drug reactie 43 mogelijk gemaakt . Nogmaals, de precieze plaats van de injectieplaats is variabel en beschadigt normaliter normaal weefsel. Zo hebben vroegere methoden van embryonale hersentransplantaties vaak de levensvatbaarheid van de gastheren in gevaar gebracht, waardoor deze studies beperkt zijn tot een korte termijnanalyse ( dwz 2 tot 14 dagen), waardoor de variatie tussen individuele injecties veroorzaakt wordt door de verduisterde injectieplaatsen, waardoor de long- Termijnanalyse van celgedrag en drugresponsen of van transplantatie over meerdere generaties.
De hier beschreven werkwijze richt zich op de huidige beperkingen in zebravis embryonale en immuun-gecompromitteerde transplantatietechnieken door onderzoekers in staat te stellen: 1) reproduceerbaar op dezelfde locatie te injecteren, met minimale schade aan het omliggende weefsel; 2) de plaats van injectie direct visualiseren om te maximaliserenEngraftment efficiency; 3) honderden embryo's per dag transplanteren; 4) tumoren laten groeien in immuun-competente dieren; 5) het mogelijk maken om het gedrag van tumorcellen en duurzame geneesmiddelenreacties over het leven van de zebravis te monitoren; En 6) de re-transplantatie van tumoren over vele generaties mogelijk maken voor mogelijke studies over tumor evolutie of drug terugval mechanismen. Bovendien stelt dit protocol onderzoekers in staat om elk zebravisgenotype te gebruiken voor de beoordeling van gastheerrespons, inclusief verschillende immuunpopulaties. Deze eigenschappen maken deze methode gemakkelijk aan te passen door een lab dat al standaard microinjecties in zebravis uitvoert. Tenslotte, hoewel deze methode ideaal is voor orthotopische injecties van zebravis hersentumoren bij het transplanteren van andere tumortypen, zoals lever of pancreas, kan de orthotopische plaats belangrijker zijn dan immuuncompetentie ( bijv. Als een onderzoeker de effecten van de stromale Micro-omgeving op tumorgroei). In dit scenario, deNieuw ontwikkelde immuun-deficiënte zebravismodellen kunnen meer geschikt zijn voor het uitvoeren van orthotopische tumortransplantaties 11 .
Dit protocol is gebruikt om tumorcelcompetitiebepalingen uit te voeren en dubbelgemerkte tumoren te injecteren. Een mogelijke behandelingsstrategie voor de beoordeling van de effectiviteit van chemische verbindingen op tumorigenese, waarbij de behandeling van embryo's na transplantatie via de toevoeging van het geneesmiddel naar water wordt behandeld, werd ook besproken. Een werkwijze voor de ex vivo behandeling van tumorcellen voorafgaand aan transplantatie werd ook eerder gemeld 17 . Daarnaast zijn getransplanteerde tumoren samengevoegd voor meerdere ronden van re-transplantatie, die gunstig zullen zijn voor studies van tumor evolutie en chemoresistentie 17 . Momenteel zijn preklinische studies afhankelijk van muizen xenografen om de werkzaamheid van potentiële verbindingen te beoordelen. Deze studies zijn echter tijdrovendEn kostbaar. Gezien de hoge mate van instandhouding van oncogene signaleringsbanen tussen zebravis en mensen 28 , kan men verwachten dat deze methode de conventionele muis- en menselijke celstudies zal aanvullen om de snellere identificatie van effectieve verbindingen in preklinische en klinische proeven mogelijk te maken. Uiteindelijk kan deze methode nuttig zijn voor de snelle chemische screening van primaire patiënttumoren, die het gepersonaliseerde initiatief verder kunnen voortzetten. De voorwaarden voor de langetermijngroei van menselijke cellen in zebravis (volwassen of embryo) moeten echter nog worden geïdentificeerd.
The authors have nothing to disclose.
We bedanken de twee recensenten voor uitstekende suggesties en verbeteringen aan het manuscript. We danken ook Huntsman Cancer Institute / University of Utah voor de veeteelt en onderhoud. Dit werk werd gefinancierd door de American Cancer Society (# 124250- RSG-13-025-01-CSM), een NIH-subsidie (P30 CA042014 CRR-programma), de Universiteit van Utah Seed Grant en de Huntsman Cancer Foundation.
Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
50 ml beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
1000 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
100 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
50 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
15 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
1.7 ml microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |