암 세포의 이식은 암 기전과 치료 반응의 확인에 중요한 도구입니다. 현재의 기술은 면역 기능이없는 동물에 달려 있습니다. 여기, 우리는 종양 세포 행동과 생체 내 약물 반응의 장기 분석을위한 면역 능력이있는 배아에 zebrafish 종양 세포를 이식하는 방법을 설명합니다.
종양 세포 이식은 암세포 성장, 이동 및 숙주 반응을 제어하는 메커니즘을 정의하고 치료에 대한 잠재적 인 환자 반응을 평가하는 중요한 기술입니다. 현재의 방법은 종양 이식편의 거부를 피하기 위해 동종 또는 면역 저하 동물을 사용하는 것에 크게 의존합니다. 이러한 방법은 종종 면역 – 종양 세포 상호 작용의 분석을 방해하거나 특정 유전 적 배경으로 제한되는 특정 유전 변종의 사용을 필요로합니다. zebrafish의 다른 방법은 종양 세포를 단기 검사 ( 즉, 3 ~ 10 일)에 사용하기 위해 이식 한 3 일 전에 배아 뇌에서 불완전하게 발달 된 면역 시스템을 이용합니다. 그러나, 이러한 방법은 종양 세포의 행동과 약물 반응에 대한 장기적인 연구를 방해하는 숙주의 치사율을 유발합니다. 이 프로토콜은 zebrafish 뇌종양 조직의 장기간 동위 원소 이식을위한 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다.2 일 된 면역 기능을 갖춘 제브라 피쉬의 제 4 뇌실로 옮긴다. 이 방법은 1) 침입 및 보급과 같은 종양 세포 행동의 장기 연구; 2) 마약에 대한 내성 종양 반응; 및 3) 종양 진화 및 / 또는 상이한 숙주 유전 적 배경의 영향 연구를위한 종양의 재 이식. 요약하면이 기술을 통해 암 연구원은 먼 곳에서의 생착, 침입 및 성장을 평가할 수있을뿐 아니라 여러 달 동안 화학 스크린 및 세포 경쟁 분석을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 종양 유형의 연구로 확장 될 수 있으며 chemoresistance 및 전이의 메커니즘을 명료하게하는 데 사용할 수 있습니다.
종양 세포를 면역이 손상된 동물, 특히 마우스 이종 이식 물에 이식하는 것은 암세포 증식 1 , 2 , 생존, 침입 및 전이 3 , 4 를 제어하는 메커니즘을 연구하고 플랫폼을 제공하는 데 널리 사용되는 기술이다 약물 검사 5 , 6 , 7 . 최근 면역 원성 손상된 마우스에 일차 종양 샘플을 이식하는 것은 진단 및 전임상 약물 스크리닝 목적을위한 환자 유래 이종 이식 (PDX) 모델을 생성하는 데 사용되어 왔으며 개인 맞춤 의학 이니셔티브의 백본입니다 8 , 9 , 10 , 11 . 그러나, 중요한 증거는 면역 체계를 조절한다는 것을 보여줍니다줄기는 종양의 행동과 환자의 결과에 큰 영향을 미칠 수 있습니다 12 , 13 . 이것은 이종 이식 기술의 재 설계를 주도하여 인간 면역계와 종양 세포를 공동 이식함으로써 마우스의 면역계가 재구성되는 "인간화 된"쥐를 포함하도록 유도했다. 그러나이 방법은 기술 비용과 함께 다양한 재현성 및 독성으로 기술적으로 어려움이 있습니다 14 , 15 . 따라서 암 전이 및 약물 반응에 대한 면역 및 종양 특이 적 기전의 발견을 가속화시키기 위해서는 면역력이있는 동물에서의 새로운 이식 기술이 필요하다.
Zebrafish는 인간 암 연구를위한 대체 동물 모델입니다. 20 가지 이상의 암 모델이 현재 16 가지 로 확립되었습니다. 악성 뇌 17 , mela noma 18 , 19 , 20 및 췌장암 21 , 22 뿐만 아니라 많은 백혈병 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . zebrafish 시스템의 두 가지 특성은 암 연구에 특히 적합합니다. 1) 반투명 동물의 광학 투명도는 간단한 현미경 기술을 사용하여 암 세포 행동 ( 즉, 증식, 생존, 침입 및 보급)을 직접 시각화 할 수 있으며 2) 여성 제브라 피쉬는 하루에 최대 200 개의 배아를 생산할 수 있기 때문에 저렴한 비용으로 유전이나 약물 검사를위한 동물 수를 신속하게 조정할 수 있습니다. 또한, 제브라 피쉬 (zebrafish)와 인간의 암 게놈은 (암 유전자와 종양 억제 유전자를 포함한) 고도로 보존되어 있으며,f "> 28, 기계적 및 약물 발견이 포유류 시스템으로 신속하게 전환 될 수 있도록 해줌으로써 zebrafish는 이미징, 확장 성 및 시스템 비용의 이점을 취하는 이식 기술을위한 이상적인 동물 모델이됩니다.
면역 손상된 제브라 피시의 종양 이식 연구는자가 재생 능력, 종양 악성 종양 및 침입 / 보급을 확인하는 데 도움을주었습니다 11 , 29 . 종양 세포 행동에 대한 단기 연구는 면역 체계가 ~ 20 일 동안 효과적으로 억제 된 γ- 선 조사 된 성인에게 이식 한 후에 수행 될 수있다. 성인 제브라 피쉬의 dexamethasone 처리는 거부 반응이 일어나기 30 일 전부터 B 세포와 T 세포를 억제합니다 31 . 또 다른 덜 일반적인 전략은 클론 제브라 피스 균주를 사용합니다면역 능력이있는 숙주에서 장기간 조사가 가능합니다. 그러나 제한된 수의 클론 균주가 생성되었고 낮은 생산성으로 인해 유지하기가 어렵습니다. 또한, 확립 된 제브라 피쉬 종양 모델의 대부분은 다른 유전 적 배경에서 생성되므로 이러한 종양은 면역 계통을 억제하지 않고 클론 균주에 이식 할 수 없습니다. 장기 이식 연구를 개선하기위한보다 최근의 접근법으로는 여러 암 35,36 을 성공적으로 이식하기 위해 사용 된 손상된 B 세포 및 T 세포 기능을 가진 rag2 E450fs 돌연변이 계통의 개발이 포함됩니다. 클론 제브라 피쉬 라인이나 면역이 손상된 숙주에 대한 요구를 피하기 위해 많은 그룹이 초기 단계의 배아를 사용했습니다 ( 즉, > 72 hpost-fertilization (hpf))에 대한 적응증이 아직 없다.이 배아는 아직 적응 면역계를 완전히 개발하지 못했기 때문에 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . 그러나이 방법은 인간 암세포 또는 이식 기술 자체가 숙주를 사멸시켜 장기간의 연구와 재 이식을 방지하기 때문에 종양 세포 행동 또는 약물 반응 (일반적으로 2 주 미만)에 대한 단기 분석으로 제한됩니다.
이 프로토콜은 수정 된 배아 이식 방법을 배아 이틀 후 수정 (dpf) 뇌의 네 번째 뇌실 루멘에 자세히 설명합니다. 그것은 숙주에 대한 독성을 최소화하고 종양 세포의 장기 생장을위한 zebrafish 뇌종양 모델과 결합 될 수 있습니다. 따라서,이 기술은숙주 / 면역 반응, 약물 반응 또는 전이 잠재성에 대한 향후 연구를 촉진하여 여러 세대에 걸쳐 종양 세포를 새로운 숙주로 재 이식 할 수있는 기회를 제공합니다. 이 방법은 또한 단순하고 효율적이며 확장 성이 뛰어나며 최대 90 %의 생착율로 하루에 단일 사용자가 최대 300 회의 이식을 수행 할 수 있습니다. 이것은 유전자 또는 약물 스크리닝 프로젝트를 위해 2 dpf의 수백 개의 배아로 단일 원발 종양을 빠르게 번식 시키거나 수개월에 걸쳐 다른 숙주 배경에서 뇌종양 세포 행동을 직접 시각화 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 완벽하게 유능한 면역계를 개발할 2-dpf 배아의 심실에 제브라 피쉬 종양 세포를 주입하는 과정을 포함하는 간단하고 효율적인 이식 법을 상세히 설명합니다. 지금까지 zebrafish CNS-PNET 17 과 흑색 종 (데이터는 표시되지 않음)이 종양 세포의 행동과 침습에 대한 장기 연구를 위해 성공적으로 이식되었습니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 적절한 바늘 구멍 크기 및 적절한 종양 세포 현탁액을 적절하게 마취 호스트 배아를 보장 포함합니다. 각 연구원에 대해이 기술의 추가 최적화에는 종양 세포 농도, 주입 압력 및 배아 방향 조정이 포함될 수 있습니다. 또한 다른 종양에서 유래 된 현탁액의 점도에는 이질성이있을 수 있으므로 다른 종양 유형은 재발 성 및 이식이 다소 어려울 수 있습니다. 그러나, 니들 보어 크기를 조정하고 diffe를 사용하여종양 현탁액을 희석 시키면 종양 점도와 관련된 어려움을 극복 할 수 있습니다.
우리의 경험에서, 심실의 드문 드문 한 세포 / 불규칙한 세포 덩어리에 대한 가장 일반적인 이유는 다음과 같습니다 : 1) 종양 세포 현탁액이 너무 희박합니다. 2) 니들 보어 크기가 너무 작습니다. 3) 분사 시간과 압력이 너무 낮습니다. 및 / 또는 4) 남아있는 조직은 종양으로부터 여과되지 않고 바늘에 박혀 있었다. 종양 세포 현탁액이 주사 후 심실 밖으로 흘러 나올 때 그것은 1) 뇌실 바닥에 바늘을 놓는 것; 2) 높은 사출 압력과 시간; 및 / 또는 3) 너무 큰 니들 보어 크기. 이식 된 배아의 낮은 생존율은 1) 오랜 기간 동안 태아를 마취하는 것; 2) 사출 판에 배아를 남기고 건조시킨다. 3) 심실 내로 기포의 주입; 및 / 또는 4) 뇌와 같은 중요한 장기를 관통하고바늘이 심실을 통과했기 때문에 심장.
성인 또는 배아 제브라 피시 뇌에서 종양 이식의 이전 방법은 성인의 면역 억제 (유 전적으로, 약리학 적으로 또는 방사선을 통한)에 의존하거나 배아 38 , 43 , 52 , 53 , 54 의 인간 또는 마우스 세포에 대한 단기 연구로 제한됩니다 . 예를 들어, 마우스 뇌종양은 단기 (~ 2 일) 전임상 약물 검사에서 사용하기 위해 dexamethasone 면역 억제 된 30-dpf, 청소년 제브라 피쉬에 비강 내 주사 할 수 있습니다. 그러나 이러한 실험에서 주사 부위는 두개골과 뇌 조직에 의해 가려져 정상적인 뇌 조직에 손상을 줄 수 있으며 이로 인해 숙주 생존력과 생장 효율이 저하됩니다. 최근에 설명 된 또 다른 방법은 인간 glioblastoma 세포주는 zebrafish 배아의 중뇌 영역으로 이동하여 성장, 침입 및 약물 반응의 단기 분석을 가능하게했다. 다시, 주사 부위의 정확한 위치는 가변적이며 정상 조직을 손상시킬 가능성이 있습니다. 따라서 배아 뇌 이식의 이전 방법은 종종 단기간의 분석 ( 즉, 2 일에서 14 일)으로 제한하여 이러한 연구를 불분명 한 주사 부위로 인한 개별 주사 간의 가변성을 증가시키고, 세포 행동 및 약물 반응 또는 여러 세대에 걸친 재 이식의 장기 분석.
여기에 설명 된 방법은 zebrafish 배아 및 면역 손상된 이식 기술의 현재 한계를 해결합니다. 연구원은 다음을 수행 할 수 있습니다. 1) 주변 조직에 대한 최소한의 손상으로 동일한 위치에 재현 가능하게 주사합니다. 2) 주입 부위를 직접 시각화하여 최대화생화 효율; 3) 하루 수백 마리의 배아 이식. 4) 면역 기능이있는 동물에서 종양이 자랄 수 있도록한다; 5) zebrafish의 수명 동안 종양 세포 행동 및 내약성 약물 반응을 모니터링 할 수 있습니다. 6) 종양의 진화 또는 약물 재발 기전에 대한 잠재적 인 연구를 위해 여러 세대에 걸친 종양의 재 이식이 가능하다. 또한,이 프로토콜은 연구자들이 다른 면역 집단을 포함한 숙주 반응 평가를 위해 모든 제브라 피쉬 유전자형을 이용할 수있게 해줍니다. 이러한 특성으로 인해이 방법은 이미 제브라 피쉬에서 표준 마이크로 인젝션을 수행하는 모든 실험실에서 쉽게 적용 할 수 있습니다. 마지막으로,이 방법은 zebrafish 뇌종양의 정위 주입에 이상적이지만, 간이나 췌장과 같은 다른 종양 유형을 이식 할 때 동위체 부위가 면역 능력보다 더 중요 할 수 있습니다 ( 예 : 연구자가 간질의 영향을 연구하는 경우 종양 성장에 대한 미세 환경). 이 시나리오에서새로 개발 된 면역 결핍 성 제브라 피쉬 모델은 정위 이식 종양 이식을 수행하는 데 더 적합 할 수 있습니다 11 .
이 프로토콜은 종양 세포 경쟁 assays을 수행하고 이중 라벨 종양을 주입하는 데 사용되었습니다. 물에 약물을 첨가하여 이식 후 배아의 치료를 포함하는 종양 발생에 대한 화합물의 유효성 평가를위한 잠재적 치료 전략도 논의되었다. 이전에 종양 세포를 ex vivo로 치료하는 방법도 이전에보고되었다. 또한, 이식 된 종양은 여러 번 이식하여 다시 종양의 진화 및 항암 화학 요법에 도움이 될 것입니다. 현재, 전임상 연구는 잠재적 인 화합물의 효능을 평가하기위한 마우스 이종 이식에 의존합니다. 그러나,이 연구는 시간이 많이 소요됩니다그리고 값 비싼. 제브라 피쉬와 인간 사이의 발암 신호 전달 경로의 높은 수준의 보존을 고려할 때,이 방법은 전임상 및 임상 시험에 들어가는 효과적인 화합물의보다 신속한 확인을 위해 기존의 마우스 및 인간 세포 연구를 보완 할 것으로 예상됩니다. 궁극적으로,이 방법은 1 차 환자 종양의 신속한 화학적 스크리닝에 유용 할 수 있으며, 이는 개인화 된 의학 이니셔티브를 추진할 수 있습니다. 그러나, 제브라 피쉬 (성인 또는 배아)에서 인간 세포의 장기간 성장을위한 조건은 여전히 확인 될 필요가있다.
The authors have nothing to disclose.
원고에 대한 훌륭한 제안과 개선 사항에 대해 두 명의 평론가에게 감사드립니다. 우리는 또한 축산 및 유지 관리를 위해 유타 대학 헌츠 만 암 연구소 (Huntsman Cancer Institute) / 유타 대학에 감사드립니다. 이 연구는 미국 암 협회 (# 124250-RSG-13-025-01-CSM), NIH 교부금 (P30 CA042014 CRR 프로그램), Utah Seed Grant 대학 및 Huntsman Cancer Foundation의 지원을 받았다.
Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
50 ml beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
1000 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
100 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
50 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
15 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
1.7 ml microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |