השתלת תאי סרטן היא כלי חשוב לזיהוי מנגנוני סרטן ותגובות טיפוליות. הטכניקות הנוכחיות תלויים בבעלי חיים חסרי יכולת. כאן, אנו מתארים שיטה להשתלת תאים דג הזברה תאים לתוך עוברי המוסמכת-המוסמכת לניתוח לטווח ארוך של התנהגות התא הגידול בתגובות סמים vivo .
השתלת תאים סרטניים היא טכניקה חשובה להגדרת המנגנונים השולטים בצמיחת תאים סרטניים, בהגירה ובתגובה המארחית, וכן בהערכת התגובה הפוטנציאלית של המטופל לטיפול. השיטות הנוכחיות תלויים בעיקר בשימוש בחיות סינגניות או חיסוניות, כדי למנוע דחייה של השתל הגידול. שיטות כאלה מחייבות שימוש זנים גנטיים ספציפיים, כי לעתים קרובות למנוע ניתוח של אינטראקציות תאים סרטניים החיסונית ו / או מוגבלים רקע גנטי מסוים. שיטה חלופית דג הזברה מנצל את מערכת החיסון שפותח בשלמותו של המוח העוברי לפני 3 ימים, שבו תאים סרטניים מושתלים לשימוש מבחני לטווח קצר ( כלומר, 3 עד 10 ימים). עם זאת, שיטות אלה לגרום קטלני המארח, אשר מונע את המחקר לטווח ארוך של התנהגות תאים סרטניים בתגובה לתרופה. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה להשתלה אורטופטית לטווח ארוך של רקמת גידול דג הזברה של המוח באל החדר הרביעי של דג הזברה בן 2 ימים החיסון המוסמכת. שיטה זו מאפשרת: 1) מחקר ארוך טווח של התאים התא הגידול, כגון פלישה והפצה; 2) תגובה מתמשכת של הגידול לסמים; ו 3) השתלה מחדש של גידולים לחקר האבולוציה הגידול ו / או את ההשפעה של רקע גנטי שונים המארח. לסיכום, טכניקה זו מאפשרת לחוקרי סרטן להעריך engraftment, פלישה, צמיחה באתרים מרוחקים, כמו גם לבצע מסכים כימיים מבחני תחרות התא במשך חודשים רבים. פרוטוקול זה ניתן להרחיב מחקרים של סוגי גידול אחרים וניתן להשתמש בהם כדי להבהיר מנגנונים של chemoresistance ו גרורה.
ההשתלה של תאים סרטניים לתוך בעלי חיים נפגעת החיסון, במיוחד xenografts העכבר, היא טכניקה בשימוש נרחב המשמש ללמוד מנגנונים השליטה התפשטות תאים סרטניים 1 , 2 , הישרדות, פלישה, גרורות 3 , 4 , כמו גם כדי לספק פלטפורמה עבור סיקור סמים 5 , 6 , 7 . לאחרונה, השתלת דגימות גידולים ראשוניות לעכברים שנפגעו במערכת החיסונית שימשה ליצירת מודלים של קסנוגרפט (PDX) הנגזרות על ידי המטופל לצורך בדיקות אבחון ופרה-קליניות, והיא עמוד השדרה של היוזמה הרפואית 8 , 9 , 10 , 11 . עם זאת, ראיות משמעותיות מראה כי modulating את החיסון syגזע יכולה להיות השפעה דרמטית על התנהגות הגידול ותוצאות החולה 12 , 13 . זה הביא את העיצוב מחדש של טכניקות המבוססות על xenograft כדי לכלול עכברים "אנושיים", שבהם המערכת החיסונית של העכבר היא מחדש על ידי שיתוף השתלת תאים החיסון האנושי עם תאים סרטניים. עם זאת, גישה זו עדיין מאתגר מבחינה טכנית, עם reproducibility ו רעילות משתנה הקשורים הטכניקה, בנוסף העלות המשמעותית 14 , 15 . לכן, יש צורך בטכניקות השתלה חדשות בבעלי חיים בעלי יכולת חיסונית כדי להאיץ את גילוים של מנגנונים ספציפיים החיסוניים ושל הגידול של התקדמות הסרטן ותגובת הסמים.
דג הזברה הם מודל חיות אלטרנטיבי לחקר הסרטן האנושי, עם למעלה מ -20 דגמי סרטן עכשיו הוקמה 16 , כולל מוח מאוד ממאיר 17 , מלח נומה 18 , 19 , 20 , סרטן הלבלב 21 , 22 , כמו גם לוקמיה רבים 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . שתי תכונות של מערכת דג הזברה הופכות אותו לנכון במיוחד לחקר הסרטן: 1) הבהירות האופטית של בעלי חיים שקופים מאפשרת הדמיה ישירה של התנהגויות תאים סרטניים ( כלומר, התפשטות, הישרדות, פלישה והפצה) תוך שימוש בטכניקות מיקרוסקופיות פשוטות 2) נקבה דג הזברה יכול לייצר עד 200 עוברי ליום, המאפשר קנה המידה מהירה של מספרי בעלי חיים עבור בדיקות גנטיות או סמים בעלות נמוכה. בנוסף, הגנום הסרטני של דג הזברה ובני אדם שמורים מאוד (כולל אונקוגנים וגנים מדכאי גידולים)F "> 28, המאפשרת לתגליות מכניסטיות ותרופות לתרגם במהירות למערכות יונקים.מאפיינים אלה גם להפוך את דג הזברה מודל חיות אידיאלי עבור טכניקות השתלה, אשר מנצלים את הדמיה, מדרגיות, ועלות נמוכה של המערכת.
מחקרים קודמים השתלת הגידול של דג הזברה נפגעת החיסון יש להקל על זיהוי של יכולות חידוש עצמי, ממאירות הגידול, פלישה / הפצה 11 , 29 . מחקרים קצרי טווח על התנהגות תאים סרטניים יכולים להתבצע לאחר ההשתלה למבוגרים המוקרנים γ, שמערכת החיסון שלהם מדוכאת ביעילות במשך 20 ימים 11 , 30 . הטיפול דג הזברה מבוגר עם dexamethasone מדכא B- ו- T תאים עד 30 יום לפני הדחייה מתרחשת 31 . אסטרטגיה אחרת פחות נפוצה מעסיקה זנים דג הזברה משובטיםהמאפשרים חקירה ארוכת טווח במארח החיסון המוסמכת. עם זאת, רק מספר מוגבל של זנים משובטים נוצרו וקשה לשמור בשל פוריות נמוכה. בנוסף, רוב דגמי דג הזברה הוקמה נוצרו ברקעים גנטיים אחרים, ולכן אלה לא ניתן להשתיל לתוך זנים משובטים מבלי לדכא את המערכת החיסונית 11 , 33 , 34 . גישות חדשות יותר כדי לשפר את השתלות לטווח ארוך מחקרים כוללים את הפיתוח של מוטציה rag2 E450fs מוטציה, עם B- התאים B ו- T תאים, אשר שימש בהצלחה להשתלות מספר רב של סרטן 35 , 36 . כדי לעקוף את הדרישה של קווי דג הזברה משובטים או מארח החיסונית החיסונית, מספר קבוצות השתמשו בשלב מוקדם עוברי ( כלומר, > 72 כ"סOst-fertilization (hpf)) עבור השתלת תאי גידול אנושיים, מאחר שעוברים אלה עדיין לא פיתחו מערכת חיסונית אדפטיבית 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . עם זאת, שיטות אלה מוגבלות לניתוח קצר טווח של התנהגות תאים סרטניים או בתגובה לתרופה (בדרך כלל פחות משבועיים), משום שתאי הסרטן האנושיים או טכניקת ההשתלה עצמם הורגים את המארח, ומניעת מחקרים ארוכי טווח והשתלה מחדש.
פרוטוקול זה משתנה שיטת השתלות עובריים השתנה לתוך לומן של החדר הרביעי של 2 יום שלאחר הפריה (dpf) המוח העובר. זה ממזער את הרעילות למארח והוא יכול להיות משולב עם דג הזברה דגמי המוח עבור engraftment לטווח ארוך של תאים סרטניים. לכן, טכניקה זו אלל-השתלה מחדש של תאים סרטניים למארחים חדשים על פני דורות רבים, ומאפשר מחקרים עתידיים על הטרוגניות הגידול, מארח / תגובות החיסון, תגובות סמים, או פוטנציאל גרורתי. שיטה זו היא גם פשוטה, יעילה, וניתן להרחבה, עד 300 השתלות יכול להתבצע על ידי משתמש יחיד ליום, עם עד 90% engraftment. זה מאפשר התפשטות מהירה של גידולים ראשוניים בודדים לתוך מאות עוברים ב 2 dpf עבור פרויקטים גנטיים או סמים הקרנה או ישירות לדמיין את ההתנהגות במוח הגידול התא ברקעים שונים המארח במשך חודשים רבים.
פרוטוקול זה פרטים assay השתלה פשוטה ויעילה הכוללת הזרקת תאים סרטניים דג הזברה לתוך החדר של העובר 2-dpf כי יפתחו מערכת החיסון המוסמכת לחלוטין. עד כה, דג הזברה CNS-PNET 17 ומלנומה (נתונים לא מוצגים) כבר השתיל בהצלחה למחקרים לטווח ארוך של התנהגות התא הגידול הפלישה. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים הבטחת המחט המתאימה נשא גודל ואת ההשעיה תא הגידול הנכון כראוי עוברי המארח anesthetizing. עבור כל חוקר בודד, אופטימיזציה נוספת של טכניקה זו עשויה לכלול את ההתאמה של ריכוז תאי הגידול, לחץ הזרקה, ואת העובר אוריינטציה. בנוסף, יכולה להיות הטרוגניות בצמיגות של השעיות שמקורן בגידולים שונים, ולכן סוגים שונים של גידולים עלולים להיות פחות או יותר קשים להשעייה מחדש ולהשתלה. עם זאת, על ידי התאמת המחט נשא את גודל ושימוש diffeדילולים להשכרה של ההשעיה הגידול, ניתן להתגבר על קשיים הקשורים צמיגות הגידול.
מניסיוננו, הסיבות הנפוצות ביותר עבור תאים דלילים / מסת תאים לא עקביים בחדר הם כדלקמן: 1) ההשעיה תא הגידול הוא מדולל מדי; 2) המחט נשא את גודל קטן מדי; 3) זמן ההזרקה והלחץ נמוכים מדי; ו / או 4) רקמות הנותרים לא מסוננים מן הגידול והם תקועים במחט. כאשר ההשעיה תא הגידול זורם מתוך החדר לאחר הזריקה, סביר להניח בשל: 1) המיקום של המחט נגד הרצפה של החדר; 2) לחץ הזרקת זמן גבוהה; ו / או 3) מחט נשא גודל גדול מדי. הישרדות נמוכה של עוברים המושתלים יכולה להיגרם על ידי: 1) עוברים הרדמה במשך תקופה ארוכה של זמן; 2) עוזב עוברים על צלחת ההזרקה להתייבש; 3) הזרקה של בועות אוויר לתוך החדר; ו / או 4) איברים חיוניים, כגון המוחהלב, כי המחט עברה דרך החדר.
שיטות קודמות של השתלת הגידול במוח מבוגר או דג הזברה עובריים מסתמכים על דיכוי חיסוני במבוגרים (גנטית, פרמקולוגית או באמצעות קרינה) או מוגבלים למחקרים קצרי טווח של תאים אנושיים או עכברים בעוברים 38 , 43 , 52 , 53 , 54 . לדוגמה, גידולים במוח העכבר יכול להיות מוזרק intranasally לתוך dexamethasone-immunosuppressed, 30-dpf, דג הזברה לנוער לשימוש לטווח קצר (~ 2 ימים) לפני בדיקות קליני סמים 54 . עם זאת, האתר של הזרקת בניסויים אלה הוא מוסתר על ידי הגולגולת ואת רקמות המוח ואת התוצאות הסבירות נזק לרקמת המוח הרגילה, אשר מפחית את הכדאיות המארחת ויעילות engraftment. שיטה נוספת המתוארת לאחרונה כרוכה בהזרקה של גלובוס אנושישורות תאים האחרון לתוך אזור המוח התיכון של עוברי דג הזברה, אשר אפשרה ניתוח לטווח קצר של צמיחה, פלישה, ותגובת סמים 43 . שוב, המיקום המדויק של אתר ההזרקה משתנה ונזק סביר לרקמה רגילה. לכן, שיטות קודמות של השתלות מוח עובריות לעיתים קרובות לסכן את הכדאיות של המארחים, הגבלת מחקרים אלה לטווח קצר ניתוח ( כלומר, 2 עד 14 ימים), גרימת השתנות מוגברת בין הזרקות בודדות בשל אתרי הזרקה מוסתר, ניתוח לטווח ארוך של התנהגויות התא תגובות סמים או השתלה מחדש על פני דורות מרובים.
השיטה המתוארת כאן כתובות המגבלות הנוכחיות דג הזברה טכניקות השתלת החיסון נפגעת על ידי המאפשר לחוקרים: 1) להזריק לשחזור באותו מקום, עם נזק מינימלי לרקמה הסובבת; 2) לדמיין ישירות את האתר של הזרקת למקסםיעילות engraftment; 3) השתלת מאות עוברים ביום; 4) לאפשר לגידול לצמוח בחוסן המוסמכת בעלי חיים; 5) לאפשר ניטור של התנהגות תאים סרטניים ותגובות עמידות על פני החיים של דג הזברה; ו 6) לאפשר השתלה מחדש של גידולים על פני דורות רבים עבור מחקרים פוטנציאליים על אבולוציה הגידול או מנגנוני הישנות סמים. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לנצל כל גנוטיפ דג הזברה להערכת התגובה המארחת, כולל אוכלוסיות שונות החיסון. תכונות אלה להפוך את השיטה הזו בקלות להתאמה על ידי כל מעבדה כי כבר מבצע microinjections תקן דג הזברה. לבסוף, בעוד שיטה זו אידיאלית להזרקות אורטופוטיות של גידולי מוח דג הזברה, כאשר השתלת סוגים אחרים של הגידול, כגון כבד או לבלב, האתר האורתופטי עשוי להיות חשוב יותר מאשר היכולת החיסונית ( למשל, אם חוקר לומד את ההשפעות של stromal Microenvironment על הגידול הגידול). בתרחיש זה,פיתח, דגמי דג הזברה חסרים החיסון עשוי להיות מתאים יותר לביצוע השתלות הגידול Orththotopic 11 .
פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי לבצע בדיקות תאי גזע הגידול להזריק פעמיים שכותרתו גידולים. כמו כן, נדון באסטרטגיה טיפולית פוטנציאלית להערכת יעילותם של תרכובות כימיות על גידולים, הכוללים את הטיפול בעוברים שלאחר ההשתלה באמצעות הוספת התרופה למים. שיטה לטיפול vivo לשעבר של תאים סרטניים לפני ההשתלה דווח בעבר גם 17 . בנוסף, גידולים המושתלים נאספו עבור מספר סיבובים של השתלה מחדש, אשר יהיה מועיל למחקרים על התפתחות אבולוציה chemoresistance 17 . נכון לעכשיו, מחקרים פרה קליניים תלויים xenografts העכבר כדי להעריך את היעילות של תרכובות פוטנציאליות. עם זאת, מחקרים אלה הם זמן רבויקר. בהתחשב במידת השימור הגבוהה של נתיבי איתות אונקוגניים בין דג הזברה לבני אדם 28 , יש לצפות ששיטה זו תשלים את הערכים הקונבנציונאליים של עכבר ותאי תאים אנושיים, על מנת לאפשר זיהוי מהיר יותר של תרכובות יעילות הנכנסות לניסויים קדם-קליניים וקליניים. בסופו של דבר, שיטה זו יכולה להיות שימושית עבור ההקרנה הכימית המהירה של גידולים המטופל העיקרי, אשר יכול להמשיך להניע את היוזמה הרפואה מותאמת אישית. עם זאת, התנאים לצמיחה ארוכת הטווח של תאים אנושיים דג הזברה (מבוגר או עובר) עדיין צריך להיות מזוהה.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לשני המבקרים על הצעות מצוינות ושיפורים בכתב היד. אנו מודים גם צייד סרטן המכון / אוניברסיטת יוטה עבור בעלי חיים אחזקה ותחזוקה. עבודה זו מומנה על ידי האגודה האמריקאית לסרטן (# 124250-RSG-13-025-01-CSM), מענק NIH (תכנית P30 CA042014 CRR), מענק הזרעים של אוניברסיטת יוטה וקרן הסרטן של צייד האנטסמן.
Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
50 ml beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
1000 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
100 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
50 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
15 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
1.7 ml microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |