Трансплантация раковых клеток является важным инструментом для идентификации раковых механизмов и терапевтических реакций. Современные методы зависят от иммунокомпетентных животных. Здесь мы описываем метод трансплантации опухолевых клеток данио в иммунокомпетентные эмбрионы для долгосрочного анализа поведения опухолевых клеток и ответов на наркотики in vivo .
Трансплантация опухолевых клеток является важным методом определения механизмов, контролирующих рост раковых клеток, миграцию и реакцию хозяев, а также оценку возможного ответа пациента на терапию. Современные методы во многом зависят от использования сингенных или иммунокомпромиссных животных, чтобы избежать отторжения опухолевого трансплантата. Такие методы требуют использования специфических генетических штаммов, которые часто препятствуют анализу взаимодействий иммуно-опухолевых клеток и / или ограничены конкретными генетическими корнями. Альтернативный метод у рыбок данио использует незавершенно развитую иммунную систему в эмбриональном мозге до 3 дней, когда опухолевые клетки трансплантируют для использования в краткосрочных анализах ( т. Е. От 3 до 10 дней). Тем не менее, эти методы вызывают летальность организма, что препятствует долгосрочному изучению поведения опухолевых клеток и лекарственного ответа. Этот протокол описывает простой и эффективный метод долговременной ортотопической трансплантации ткани опухоли головного мозга данио вК четвертому желудочку 2-дневного иммунокомпетентного данио. Этот метод позволяет: 1) долгосрочное изучение поведения опухолевых клеток, таких как инвазия и распространение; 2) длительный ответ опухоли на лекарства; И 3) повторной трансплантации опухолей для изучения эволюции опухоли и / или воздействия различных генетических особенностей хозяина. Таким образом, эта методика позволяет исследователям рака оценивать приживление, инвазию и рост на отдаленных участках, а также проводить химические экраны и анализы клеточной конкуренции в течение многих месяцев. Этот протокол может быть распространен на исследования других типов опухолей и может быть использован для выяснения механизмов хеморезистентности и метастазирования.
Трансплантация опухолевых клеток в иммунокомпрометированных животных, особенно ксенотрансплантатов мыши, является широко используемой методикой, используемой для изучения механизмов контроля пролиферации раковых клеток 1 , 2 , выживаемости, инвазии и метастазирования 3 , 4 , а также для обеспечения платформы Для скрининга препаратов 5 , 6 , 7 . Совсем недавно трансплантация образцов первичной опухоли на мышей с иммунной системой была использована для создания моделей ксенотрансплантата (PDX), полученных пациентами, для целей диагностики и доклинической скрининга лекарственных средств и является основой инициативы персонализированной медицины 8 , 9 , 10 , 11 , Тем не менее, значительные доказательства показывают, что модулирование иммунной системыСтволовые клетки могут оказать существенное влияние на поведение опухоли и исход лечения 12 , 13 . Это привело к переориентации методов на основе ксенотрансплантатов, включая «гуманизированных» мышей, в которых иммунная система мыши восстанавливается путем совместной трансплантации иммунных клеток человека с опухолевыми клетками. Тем не менее, этот подход по-прежнему технически сложный, с переменной воспроизводимостью и токсичностью, связанной с техникой, в дополнение к значительным затратам 14,15. Таким образом, необходимы новые методы трансплантации у иммунокомпетентных животных, чтобы ускорить открытие иммунных и опухолеспецифических механизмов прогрессирования рака и лекарственной реакции.
Zebrafish – это альтернативная модель животных для исследования рака человека, в настоящее время установлено более 20 моделей рака 16 , включая высоко злокачественный мозг 17 , mela Нома 18 , 19 , 20 и рак поджелудочной железы 21 , 22 , а также многие лейкемии 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Два признака системы данио делают его особенно подходящим для исследований рака: 1) оптическая прозрачность полупрозрачных животных позволяет непосредственно визуализировать поведение раковых клеток ( т.е. пролиферацию, выживание, инвазию и распространение) с использованием простых методов микроскопии и 2) Самка данио может производить до 200 эмбрионов в день, что позволяет быстро масштабировать число животных для генетического или лекарственного скрининга при низкой стоимости. Кроме того, геномы рака рыбок данио и человека являются высококонсервативными (включая онкогены и гены-супрессоры опухолей)F "> 28, что позволяет быстро переводить открытия механики и лекарства в системы млекопитающих, что также делает рыбу данио идеальной моделью животного для трансплантации, которая использует преимущества визуализации, масштабируемости и низкой стоимости системы.
Предыдущие исследования по трансплантации опухолей у иммунокомпрометированных рыбок данио облегчили идентификацию возможностей самообновления, злокачественности опухоли и инвазии / распространения 11 , 29 . Краткосрочные исследования поведения опухолевых клеток могут быть проведены после трансплантации в γ-облученных взрослых, иммунная система которых эффективно подавляется в течение ~ 20 дней 11 , 30 . Лечение взрослых данио с дексаметазоном подавляет B- и Т-клетки в течение 30 дней до отторжения. 31 . Еще одна менее распространенная стратегия предусматривает использование клональных штаммов рыбок даниоКоторые позволяют проводить длительные исследования на иммунокомпетентном хозяине 32 . Однако было создано лишь ограниченное количество клональных штаммов, которые трудно поддерживать из-за низкой плодовитости. Кроме того, большинство разработанных моделей опухолей данио формируются в других генетических условиях, поэтому эти опухоли не могут быть трансплантированы в клональные штаммы без подавления иммунной системы 11 , 33 , 34 . Более современные подходы к улучшению долгосрочных исследований по трансплантации включают разработку мутантной линии rag2 E450fs с нарушенными функциями В- и Т-клеток, которая была использована для успешной трансплантации множественных видов рака 35 , 36 . Чтобы обойти требование клональных линий данио или иммунокомпромиссного хозяина, ряд групп использовали эмбрионы ранней стадии ( то есть > 72 л.с.(Hpf)) для трансплантации опухолевых клеток человека, так как эти эмбрионы еще не полностью развили адаптивную иммунную систему 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . Однако эти методы ограничены кратковременным анализом поведения опухолевых клеток или ответа на лекарственные средства (обычно менее 2 недель), поскольку раковые клетки человека или сама методика трансплантации убивают хозяина, предотвращая долгосрочные исследования и повторную трансплантацию.
Этот протокол детализирует модифицированный метод эмбриональной трансплантации в просвет четвертого желудочка мозга эмбриона на 2 дня после оплодотворения (dpf). Он минимизирует токсичность для организма-хозяина и может сочетаться с моделями опухолей головного мозга рыбок данио для долговременного приживления опухолевых клеток. Таким образом, этот метод alМинимумов для повторной трансплантации опухолевых клеток в новые хозяева в течение многих поколений, облегчая будущие исследования гетерогенности опухоли, реакции хозяина / иммунной системы, лекарственной реакции или метастатического потенциала. Этот метод также прост, эффективен и масштабируем, так как до одного человека в сутки может выполнять до 300 трансплантаций, при этом приживление достигает 90%. Это позволяет быстро распространять одиночные первичные опухоли на сотни эмбрионов в 2 д.ф.ф. для генетических или скрининговых проектов или напрямую визуализировать поведение опухолевых клеток головного мозга в разных фоновых условиях хозяина в течение многих месяцев.
Этот протокол детализирует простой и эффективный анализ трансплантации, который включает инъекцию опухолевых клеток данио в желудочек 2-dpf эмбриона, который будет развивать полностью компетентную иммунную систему. До настоящего времени данио-рыбка CNS-PNET 17 и меланома (данные не показаны) были успешно трансплантированы для долгосрочного изучения поведения и инвазии опухолевых клеток. Критические шаги этого протокола включают обеспечение соответствующего размера отверстия иглы и правильной суспензии опухолевых клеток и адекватного обезболивания эмбрионов хозяина. Для каждого отдельного исследователя дальнейшая оптимизация этого метода может включать корректировку концентрации опухолевых клеток, давления инъекции и ориентации эмбриона. Кроме того, может быть гетерогенность в вязкости суспензий, происходящих из разных опухолей, поэтому разные типы опухолей могут быть более или менее трудно повторно суспендировать и трансплантировать. Однако, регулируя размер отверстия иглы и используя diffeРентгеновских разведений опухолевой суспензии, можно преодолевать трудности, связанные с вязкостью опухоли.
По нашему опыту, наиболее распространенными причинами появления разреженных клеток / несогласованных клеточных масс в желудочке являются следующие: 1) суспензия опухолевых клеток слишком разбавлена; 2) размер отверстия иглы слишком мал; 3) время впрыска и давление слишком низки; И / или 4) оставшаяся ткань не была отфильтрована из опухоли и застряла в игле. Когда суспензия опухолевых клеток вытекает из желудочка после инъекции, это, вероятно, связано с: 1) размещением иглы на дне желудочка; 2) высокое давление и время впрыска; И / или 3) слишком большой размер отверстия иглы. Низкая выживаемость пересаженных эмбрионов может быть вызвана: 1) обезболиванием эмбрионов в течение длительного периода времени; 2) оставление эмбрионов на пластине для инъекции для высушивания; 3) инъекция воздушных пузырьков в желудочек; И / или 4) прокалывание жизненно важных органов, таких как мозг иСердце, потому что игла прошла через желудочек.
Предыдущие методы трансплантации опухоли у взрослых или эмбриональных головных мозга данио основываются на иммуносупрессии у взрослых (генетически, фармакологически или посредством облучения) или ограничены кратковременными исследованиями клеток человека или мыши у эмбрионов 38 , 43 , 52 , 53 , 54 , Например, опухоли головного мозга мыши могут инъецироваться интраназально в дексаметазона-иммунодепрессию, 30-dpf, ювенильных данио для использования в краткосрочных (~ 2 днях) доклинических исследованиях лекарственных средств 54 . Однако место инъекции в этих экспериментах затенено черепом и мозговой тканью и, вероятно, приводит к повреждению нормальной ткани головного мозга, что снижает жизнеспособность хозяина и эффективность приживления. Другой недавно описанный способ включает в себя инъекцию человеческого gliobКлеточных линий ластомы в область среднего мозга эмбрионов рыбок данио, что позволило провести кратковременный анализ роста, инвазии и лекарственного ответа 43 . Опять же, точное местоположение места инъекции является переменным и, вероятно, повреждает нормальную ткань. Таким образом, предыдущие методы эмбриональных трансплантаций головного мозга часто ставят под угрозу жизнеспособность хозяев, ограничивая эти исследования кратковременным анализом ( т.е. от 2 до 14 дней), вызывая повышенную вариабельность между отдельными инъекциями из-за скрытых мест инъекции и предотвращая долгосрочные Долгосрочный анализ клеточного поведения и реакции на наркотики или повторной трансплантации через несколько поколений.
Описанный здесь метод относится к текущим ограничениям в эмбриональных и иммунокомпетентных методах трансплантации рыбок данио, позволяя исследователям: 1) воспроизводимо вводить в одно и то же место с минимальным повреждением окружающей ткани; 2) непосредственно визуализировать место инъекции для максимизацииЭффективность приживления; 3) пересаживать сотни эмбрионов в день; 4) позволяет опухолям расти у иммунокомпетентных животных; 5) позволяют контролировать поведение опухолевых клеток и долговременные реакции препарата в течение жизни рыбок данио; И 6) учитывают повторную трансплантацию опухолей в течение многих поколений для потенциальных исследований эволюции опухоли или механизмов рецидива лекарств. Кроме того, этот протокол позволяет исследователям использовать любой генотип данио для оценки реакции хозяина, включая различные иммунные популяции. Эти атрибуты делают этот метод легко адаптируемым любой лабораторией, которая уже выполняет стандартные микроинъекции у рыбок данио. Наконец, хотя этот метод идеально подходит для ортотопических инъекций опухолей головного мозга данио, при пересадке других типов опухолей, таких как печень или панкреатит, ортотопический сайт может быть более важным, чем иммунная компетенция ( например, если исследователь изучает эффекты стромальной Микроокружение на рост опухоли). В этом случаеНедавно разработанные, иммунодефицитные модели данио могут быть более подходящими для выполнения ортотопических трансплантаций опухолей 11 .
Этот протокол был использован для проведения конкурентных анализов опухолевых клеток и введения двойных меченых опухолей. Обсуждалась также потенциальная стратегия лечения для оценки эффективности химических соединений при опухолевом генезе, которая включает в себя лечение эмбрионов после трансплантации через добавление лекарственного средства в воду. Ранее был также описан способ ex vivo лечения опухолевых клеток перед трансплантацией 17 . Кроме того, трансплантированные опухоли были объединены для нескольких раундов повторной трансплантации, что будет полезно для исследований эволюции опухоли и химиорезистентности 17 . В настоящее время доклинические исследования зависят от ксенотрансплантатов мыши для оценки эффективности потенциальных соединений. Однако эти исследования отнимают много времениИ дорогостоящим. Учитывая высокую степень сохранения онкогенных сигнальных путей между рыбой данио и людьми 28 , следует ожидать, что этот метод будет дополнять обычные исследования мышей и человеческих клеток, чтобы обеспечить более быструю идентификацию эффективных соединений, поступающих в доклинические и клинические испытания. В конечном счете, этот метод может оказаться полезным для быстрого химического скрининга первичных опухолей пациента, что может дополнительно стимулировать инициативу персонализированной медицины. Тем не менее, условия для долгосрочного роста клеток человека у рыбок данио (взрослый или эмбрион) все еще нуждаются в идентификации.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим двух рецензентов за отличные предложения и улучшения в рукописи. Мы также благодарим Huntsman Cancer Institute / University of Utah за животноводство и техническое обслуживание. Эта работа финансировалась Американским онкологическим обществом (№ 124250-RSG-13-025-01-CSM), грантом NIH (программа P30 CA042014 CRR), Университетом штата Юта Грантом и Фондом борьбы с охотой.
Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
50 ml beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
1000 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
100 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
50 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
15 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
1.7 ml microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |