Kuş Gribi Virüsler RNA, korumak, tespit ve sıra için bir yöntem doğrulanmış ve kuşların doğal dışkı örnekleri kullanarak uzatıldı. Bu teknik, bir soğuk zincir ve bulaşıcı virüslerin taşıma sürdürmenin gerekliliğini ortadan kaldırır ve 96-iyi bir yüksek verimli kurulum yapılabilir.
Kuş Gribi Virüsler (AIVs) insanlarda 1 de dahil olmak üzere birçok memeli, bozar. Bu AIVs neredeyse tüm olası virüs alt tipi 2 barındıran, kendi doğal hosts çeşitlidir. İnsan gribi pandemiler başlangıçta AIVs 3 kaynaklanmaktadır. Birçok ölümcül H5N1 salgınları sırasında, son yıllarda insan vakaları bildirilmiştir. Son zamanlarda yeni bir AIV ilgili gerginlik, insan nüfusunun kasıp kavuran 'domuz gribi salgını' 4 neden. Insan ticareti ve ulaşım faaliyetleri yüksek derecede patojen suşları 5 yayılması için sorumlu olacak gibi görünse de, dağılma da kısmen yabani kuşlar 6, 7 atfedilen olabilir. Ancak, tüm AIV suşları gerçek rezervuarı yabani kuşlar.
Bu ve kanatlı sektöründe ağır ticari kayıplar karşısında tepki olarak, büyük gözetim programları AIVs ekolojisi hakkında bilgi toplamak için ve bazı yüksek derecede patojen suşları 8-12 algılamak için erken uyarı sistemleri kurmak için küresel uygulanmıştır. Geleneksel virolojik yöntemlerle virüs sağlam ve analizden önce ekili gerektirir. Bu, derin dondurucu ve taşıma sırasında yerde olmak ağır biyogüvenlik prosedürleri ile sıkı soğuk zincirleri gerektirir. Bu nedenle, uzun vadeli bir gözetim, genellikle iyi donanımlı laboratuvarlara yakın birkaç alan istasyonları sınırlıdır. Lojistik hantal prosedürler uygulanmaktadır sürece uzak bölgelerde örneklenmiş olamaz. Bu sorunlar 13 tanınan, 14 ve alternatif depolama ve taşıma stratejileri (alkol veya guanidin) 15-17 araştırıldı edilmiştir. Son zamanlarda, Kraus ve ark. 18, özel bir filtre kağıdı dayalı toplamak için bir yöntem, saklama ve taşıma AIV örnekleri, tanıttı . STA kartları 19 kuru bir depolama temeli 20 RNA korumak ve iletişim 21 üzerine etkin patojenlerin kılmak. Bu çalışmada, STA kartları ters transkripsiyon PCR ve ortaya çıkan cDNA dizisi ve virüs genleri ve kararlı olabilir AIV RNA tespit etmek için kullanılabileceğini gösterdi.
AIV kullanılmış ve örnekleri ayrı ayrı ele alındı Kraus ve ark. 18 çalışmasında bir laboratuvarda izole . Burada sunulan uzantısı, Ottenby Kuş Gözlemevi (SE İsveç) ördek tuzağı yabani kuşların dışkı örnekleri saha şartlarında yöntemlerinin yararlılığı göstermek için doğrudan test edildi. Kloakal bezlerden ördek ve örnek toplama yakalamak olduğunu göstermiştir. Geçerli protokol, tek tüp işleme 96-iyi bir tasarım iş akış yukarı ölçeklendirme içerir. FTA kartları yöntemi geleneksel yöntemlere göre daha az duyarlı olmasına rağmen, büyük gözetim programları için mükemmel bir ek sağlar. Korunması için soğuk zincir veya alkol ya da guanidin olarak tehlikeli reaktifler, nakliye açısından bir güvenlik düzenlemelerine gerek kalmadan dünyanın herhangi bir yerinden gelen örneklerin toplanması ve analizi sağlar.
Burada açıklanan protokol AIV varlığı dışkı ya da benzer örnekleri ekrana ek bir yöntem sağlar. Özellikle örnek toplama, hızlı ve kolay hale getirmek için tasarlanmış. Bu sayede daha az eğitimli kişiler, avcılar ya da yaban hayatı yöneticileri olarak AI gözetim katkıda bulunmak için yapar. Mümkünse örnekleri dondurma önerilmez rağmen, soğuk zincir, uygulanması gerekir. Örneğin oda sıcaklığında bir kaç gün, laboratuvar taşıma sırasında kartları kuru kaldığı sürece, RNA molekülleri FTA kartları için bir sorun değildi. Araştırma topluluğu tarafından değerlendirilir, alkol 15 veya guanidin 16 gibi diğer non-soğutmalı depolama sistemleri, tehlikeli doğası nedeniyle özel nakliye düzenlemeleri gerektirir. Buna karşın, STA kartı yöntemi tehlikeli maddelerin nakliye gerektirmez. Ancak, bu konuda bir başka ilginç depolama ortamı, 17 ya tehlikeli değildir RNAlater ™. Örnek herhangi bir standart moleküler laboratuvarda analiz yapılabilir. Her zamanki PCR reaksiyonları ve kılcal dizilimini dışında hiçbir özel ekipman gerektirmez. Örnek toplama zaten potansiyel patojen ajanları FTA kartı antibakteriyel ve antiviral aktivite inaktive edildi çünkü tüm adımlar bir biyogüvenlik düzeyi olmadan yerine getirilebilir.
Çapraz kontaminasyon ve yabani kuş örnekleri ile sonraki yanlış pozitif örnekler çalışmalarda gözlenmemiştir. Ancak, RNA ve PCR ile çalışırken, pre-ve post-PCR adımlar için çalışma yerleri ve ayrı odalarda temizlemek için özel dikkat etmek her zaman tavsiye edilir. Davlumbaz Çalışma laboratuarda aerosol kontaminasyon riskini azaltır. Pipetleme filtre ipuçları ile yapılmalıdır.
84 örnek altı geleneksel RealTime RT-PCR yöntemi 24 ve RealTime RT-PCR Ct değerlerini bilinen olumlu olduğunu biliyorum aynı ördek aynı anda alınan numuneler üzerinde önceki bir çalışmada. Ct değerleri <30 (viral RNA yüksek konsantrasyonda belirten) ördekler yöntem kök tarafından tespit edilen iki pozitif örnekler. Geleneksel protokol ile pozitif bulunmuştur diğer dört örnek Ct değerlerinin> 30 (daha az yoğun) ve protokol tarafından tespit edilemedi.
Sadece nispeten yüksek virüs titreleri olan örnekleri bizim testinin pozitif olduğunu ve bu yöntemin duyarlılığı tüm pozitif örnekleri tespit edilememesi kaynağı olması muhtemeldir. Ayrıca, bu çalışmada örneklem büyüklüğü çok düşük olduğunu ve daha kontrollü ve titiz deneyler yapılır eğer bu yöntem tamamen geliştirilmiş ve değerlendirilmelidir. Ancak, bu örnekleri uzak bir alana toplanan olurdu, geleneksel analiz hiç mümkün olmuş olmaz. Ayrıca, bu ilk sonuçlar, daha fazla optimizasyon ihtiyacı pilot deneyler kaynaklanmaktadır. Örnek toplandıktan sonra düzenli olarak -20 ° C derin dondurucu, iki yıllık depolama bir dönem muhtemelen viral RNA kalitesini etkiledi. Bu mümkün RNA bozulması inaktive virüs oda sıcaklığında depolama ile ilgili önemli bir konudur. Alternatif sıvı, yukarıda da belirtildiği gibi saklanan örnekler, viral genom 16 uzamaktadır analizi etkileri önemli ölçüde bozulma muzdarip. Çalışmamızda test olmamakla birlikte, FTA kartları Avian İnfluenza virüsleri 25, 26 çok benzer diğer RNA sistemlerinde sağlam RNA molekülleri korumak için uygun olduğu kanıtlanmıştır.
The authors have nothing to disclose.
Biz Bert Dibbits teknik yardım için teşekkür ederim. Hayvancılık ve Genomik Grubu, Wageningen Üniversitesi, Hollanda, laboratuvar cömertçe bize ev sahipliği yaptı. Ottenby Kuş Gözlemevi, İsveç, personel, özellikle Magnus Hellström, Marcus Danielsson, Kristof Magnusson ve Stina Andersson, yeşilbaş yakalama ve örnekleme için teşekkür. Biz laboratuarda film Sanne Svensson, Jonatan Qvist ve Ottenby az film başına Axel Gjöres ve Mano Camon teşekkür ederim. Daniel Bengtson bu yayının video bölümü için güzel ördek fotoğrafları sağladı. CDC Halk Sağlığı Görüntü Kütüphanesi (PHIL; daha fazla malzeme http://phil.cdc.gov/phil/) kullanıldı: elektron mikrografı (no. 280, Dr. Erskine Palmer) ve illüstrasyon (no. 11823; Douglas Ürdün) grip virüsü. Mali destek KNJV (Hollanda Kraliyet Avcıları Derneği), Hollanda Tarım Bakanlığı, Faunafonds ve Stichting de Eik Ortaklıkları (Hollanda) tarafından verildi, İsveç Araştırma Konseyi (hibe yok. 2.007-20.774) ve AT Newflubird proje kurdu. RNA izolasyonu kimyasallar Ambion, Inc, RNA şirket cömert bir hediye edildi. Bu Ottenby Kuş Gözlemevi katkısı No 245.
Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
FTA card | Whatman | several options | |
Harris micro punch 2mm with mat | Whatman | 1154409 | |
RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
One-Step Access RT-PCR system | Promega | A1250 | or comparable |
Agarose MP | Roche | 1388991001 | multi purpose agarose |
5x loading buffer | BioRad | delivered with DNA ladder | |
EZ load 100 bp ladder | BioRad | 170-8353 | or comparable |
Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | or comparable |
ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |