Een methode om te bewaren, op te sporen en de volgorde RNA virussen van aviaire influenza werd gevalideerd en uitgebreid met behulp van natuurlijke fecesmonsters van vogels. Deze techniek verwijdert de noodzaak van het handhaven van een koelketen en behandeling van besmettelijke virussen en kan worden toegepast in een 96-wells high-throughput setup.
Aviaire Influenza virussen (AIVs) infecteren veel zoogdieren, inclusief de mens 1. Deze AIVs zijn divers in hun natuurlijke gastheren, onderdak bieden aan bijna alle mogelijke virale subtypen 2. Human pandemieën van griep oorspronkelijk voort uit AIVs 3. Veel dodelijke gevallen bij de mens tijdens de H5N1-uitbraken in de afgelopen jaren gemeld. De laatste tijd, een nieuwe AIV gerelateerde stam geveegd door de menselijke bevolking, waardoor de 'varkensgriep-epidemie' 4. Hoewel de menselijke handel en transport activiteit lijkt te zijn verantwoordelijk voor de verspreiding van hoogpathogene stammen 5, kan verspreiding ook deels worden toegeschreven aan wilde vogels 6, 7. Echter, de werkelijke bron van alle stammen AIV is wilde vogels.
In reactie op deze en in het gezicht van ernstige commerciële verliezen in de pluimvee-industrie zijn er grote bewakingsprogramma's is wereldwijd geïmplementeerd om informatie over de ecologie van AIVs te verzamelen, en om systemen voor vroegtijdige waarschuwing te installeren om bepaalde hoogpathogene stammen 8-12 op te sporen. Traditionele virologische methoden vereisen virussen intact en gecultiveerd voor de analyse. Dit vereist strenge koude ketens met diepvriezers en zware bioveiligheid procedures in de plaats worden tijdens het transport. Lange-termijn surveillance is dan ook meestal beperkt tot een paar veld stations dicht bij de goed uitgeruste laboratoria. Afgelegen gebieden kunnen niet worden bemonsterd, tenzij logistiek omslachtige procedures worden uitgevoerd. Deze problemen zijn erkend 13, 14 en het gebruik van alternatieve opslag en het transport van strategieën onderzocht (alcoholen of guanidine) 15-17. Onlangs Kraus et al.. 18 introduceerde een methode voor het verzamelen, opslaan en vervoeren AIV monsters, gebaseerd op een speciaal filter papier. FTA-kaarten 19 te behouden RNA op een droge opslag basis 20 en maken ziekteverwekkers inactief bij contact 21. Deze studie toonde aan dat FTA kaarten kunnen worden gebruikt om de AIV RNA te detecteren in reverse-transcriptie PCR en dat de resulterende cDNA kan worden gesequenced en virus genen en bepaald.
In het onderzoek van Kraus et al.. 18 een laboratorium isoleren van de AIV werd gebruikt, en de monsters werden afzonderlijk behandeld. In het verlengde hier gepresenteerde werden fecale monsters van wilde vogels uit de eend val op de Ottenby Bird Observatory (SE Zweden) direct getest om de bruikbaarheid van de methoden te illustreren onder veldomstandigheden. Vangen van eenden en sample collectie van cloacaswabs is aangetoond. Het huidige protocol omvat het opschalen van het werk vloeien voort uit enkele buis hanteren om een 96-wells design. Hoewel minder gevoelig dan de traditionele methoden, de methode van de FTA-kaarten biedt een uitstekende aanvulling op grote surveillance regelingen. Het maakt het verzamelen en analyseren van monsters van overal in de wereld, zonder de noodzaak om het handhaven van een koelketen of veiligheidsvoorschriften met betrekking tot transport van gevaarlijke reagentia, zoals alcohol of guanidine.
Het protocol hier beschreven biedt een aanvullende methode om fecaliën of soortgelijke monsters screenen op de aanwezigheid van de AIV. Het werd speciaal ontworpen om monstername snel en eenvoudig. Dit maakt het mogelijk voor minder getrainde personen, zoals jagers of wilde dieren managers, bij te dragen aan AI toezicht. Geen koele kettingen moeten worden toegepast, hoewel het bevriezen van de monsters wordt aanbevolen waar mogelijk. Een paar dagen van de ruimtetemperatuur, bijvoorbeeld tijdens het transport naar het laboratorium, waren geen probleem voor RNA-moleculen op FTA-kaarten, zolang de kaarten droog gebleven. Andere niet-gekoelde opslag systemen die momenteel worden geëvalueerd door de onderzoeksgemeenschap, zoals alcohol 15 of guanidine 16, vereisen speciale scheepvaart regelingen vanwege hun gevaarlijke aard. In tegenstelling, heeft de FTA-kaart methode geen verschepen van gevaarlijke stoffen. Echter, een andere interessante opslagmedium in dit opzicht is RNAlater ™ dat niet gevaarlijk is, hetzij 17. Monster analyse kan worden uitgevoerd in een standaard moleculair laboratorium. Geen speciale apparatuur anders dan voor normaal PCR-reacties en capillaire sequencing nodig was. Alle stappen kunnen worden uitgevoerd zonder een bioveiligheidsniveau, want al in monstername de mogelijke ziekteverwekkers werden geïnactiveerd door de antibacteriële en antivirale activiteit van de FTA kaart.
Kruisbesmetting en de daarop volgende fout-positieve monsters werden niet waargenomen in onze studies met wilde vogels monsters. Echter, bij het werken met RNA en PCR is het altijd raadzaam om speciale aandacht te besteden aan werkplekken en aparte kamers voor pre-en post-PCR stappen schoon te maken. Werken in een zuurkast verlaagt het risico van besmetting door aërosolen worden in het laboratorium. Pipetteren moet worden uitgevoerd met filter tips.
Uit een eerdere studie over monsters tegelijk uit dezelfde eenden weten we dat zes van de 84 monsters positief waren door de traditionele RealTime RT-PCR-methode 24 en de Ct-waarden van RealTime RT-PCR zijn bekend. De twee positieve monsters gedetecteerd door onze methode vloeien voort uit eenden, die Ct-waarden <30 (met vermelding van een hoge concentratie van viraal RNA) had. De overige vier monsters die positief waren met de traditionele protocol had Ct-waarden> 30 (minder geconcentreerd) en kon niet worden gedetecteerd door ons protocol.
Alleen monsters met relatief hoge virus titers waren positief in onze test en het is waarschijnlijk dat de gevoeligheid van de methode was de bron van het niet alle positieve monsters op te sporen. Verder is de steekproefgrootte in de huidige studie was zeer laag en de methode kan volledig worden ontwikkeld en beoordeeld als er meer controle en strenge experimenten worden uitgevoerd. Echter, als deze monsters zouden zijn verzameld uit een afgelegen gebied, zou de traditionele analyse niet mogelijk zijn geweest helemaal. Bovendien, deze eerste resultaten komen voort uit pilot-experimenten die verdere optimalisatie nodig hebben. Een periode van twee jaar opslag in een reguliere -20 ° C vriezer na de monsterneming waarschijnlijk ook gevolgen voor de kwaliteit van het virale RNA. Dit is mogelijk RNA degradatie is een belangrijke kwestie bij de behandeling van kamertemperatuur opslag van geïnactiveerde virussen. Monsters worden opgeslagen in alternatieve vloeistoffen zoals hierboven vermeld last van significante afbraak die analyse van de langere stukken van het virale genoom 16 effecten. Hoewel niet getest in onze studie, hebben FTA kaarten bewezen goed geschikt zijn voor intact RNA-moleculen te behouden in andere RNA systemen die erg lijken op Aviaire Influenza virussen 25, 26.
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Bert Dibbits voor technische ondersteuning. Het Animal Breeding and Genomics Group, Wageningen Universiteit, Nederland, royaal gehost ons in hun laboratorium. Het personeel van de Ottenby Bird Observatory, Zweden, is bedankt voor het vangen en bemonstering van de wilde eend, in het bijzonder Magnus Hellström, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson en Stina Andersson. Wij danken Sanne Svensson, Jonatan Qvist en Per-Axel Gjöres voor het filmen op Ottenby, en Mano Camon voor het filmen in het lab. Daniel Bengtson mooie eend foto's voorzien voor de video gedeelte van deze publicatie. Verder vrij materiaal van de CDC Volksgezondheid Image Library (PHIL, http://phil.cdc.gov/phil/ ) werd gebruikt: de electronen microscoop (nr. 280, door Dr Erskine Palmer) en illustratie (nr. 11823; door Douglas Jordanië) van het influenza virus. Financiële steun werd gegeven door de KNJV (Koninklijke Nederland Jagers Vereniging), het Nederlandse Ministerie van Landbouw, de Faunafonds en de Stichting de Eik Trusts (beide in Nederland), de Zweedse Research Council (subsidie niet. 2,007 tot 20,774) en de EG onderbouwde Newflubird project. RNA-isolatie chemicaliën waren een gulle gift van Ambion, Inc, de RNA-bedrijf. Dit is bijdrage No 245 uit de Ottenby Bird Observatory.
Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
FTA card | Whatman | several options | |
Harris micro punch 2mm with mat | Whatman | 1154409 | |
RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
One-Step Access RT-PCR system | Promega | A1250 | or comparable |
Agarose MP | Roche | 1388991001 | multi purpose agarose |
5x loading buffer | BioRad | delivered with DNA ladder | |
EZ load 100 bp ladder | BioRad | 170-8353 | or comparable |
Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | or comparable |
ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |