Eine Methode, um zu bewahren, zu erkennen und Sequenz der RNA von Vogelgrippeviren wurde validiert und erweitert mit natürlichen Kotproben von Vögeln. Diese Technik beseitigt die Notwendigkeit der Aufrechterhaltung einer Kühlkette und Handhabung von infektiösen Viren und kann in einer 96-well High-Throughput-Setup verwendet werden.
Vogelgrippeviren (AIVs) infizieren viele Säugetiere, einschließlich Menschen 1. Diese AIVs sind in ihren natürlichen Wirten diverse, Beherbergung fast alle möglichen viralen Subtypen 2. Menschliche Pandemien von Grippe ursprünglich stammen aus AIVs 3. Viele tödliche Fälle bei Menschen während der H5N1-Ausbrüche in den letzten Jahren gemeldet wurden. In letzter Zeit, ein neues AIV verbundenen Belastung durch die menschliche Bevölkerung gefegt, so dass die "Schweinegrippe-Epidemie" 4. Obwohl menschlichen Handels-und Transport-Aktivität verantwortlich zu sein scheint für die Ausbreitung der hoch pathogenen Stämmen 5, kann die Verbreitung zum Teil auch auf Wildvögel 6, 7 zurückgeführt werden. Allerdings ist die tatsächliche Reservoir aller AIV-Stämme Wildvögeln.
In Reaktion auf diese und angesichts der schweren wirtschaftlichen Verlusten in der Geflügel-Industrie, haben große Überwachungs-Programme weltweit, um Informationen über die Ökologie der AIVs sammeln und Frühwarnsysteme zu installieren, um bestimmte hoch pathogenen Stämmen 8-12 erkennen umgesetzt. Traditionelle virologischen Methoden erfordern Viren intakt zu sein und kultiviert vor der Analyse. Dies erfordert strenge Kälte-Ketten mit Tiefkühltruhen und schwere Biosicherheit Verfahren, um im Platz während des Transportes werden. Langfristige Überwachung ist daher in der Regel ein paar Feldstationen in der Nähe gut ausgestattete Labors beschränkt. Abgelegene Gebiete können nicht abgetastet, es sei denn logistisch schwerfällige Verfahren umgesetzt werden. Diese Probleme wurden 13 anerkannt, 14 und die Nutzung alternativer Lagerung und Transport Strategien untersucht (Alkohole oder Guanidin) 15-17. Kürzlich führte Kraus et al. 18 a Verfahren zur Erhebung, Speicherung und Transport AIV Proben, basierend auf einem speziellen Filterpapier. FTA Karten 19 erhalten RNA auf eine trockene Lagerung Basis 20 und machen Krankheitserreger inaktiv bei Kontakt 21. Diese Studie zeigte, dass FTA-Karten verwendet werden, um AIV RNA in Reverse-Transkriptions-PCR und die daraus resultierende cDNA konnten sequenziert und Virus-Gene ermittelt und nachgewiesen werden.
In der Studie von Kraus et al. 18 a Labor zu isolieren von AIV verwendet wurde, und die Proben wurden einzeln behandelt. In der Verlängerung hier präsentierten, wurden Kotproben von Wildvögeln aus der Ente Falle am Ottenby Bird Observatory (SE Schweden) direkt an den Nutzen der Methoden unter Feldbedingungen illustrieren getestet. Fangen von Enten und Probenentnahme durch Kloakenabstriche demonstriert. Das aktuelle Protokoll enthält up-scaling der Arbeitsabläufe aus einzelnen Röhre Umgang mit einer 96-well-Design. Obwohl weniger empfindlich als die traditionellen Methoden bietet die Methode der FTA-Karten eine hervorragende Ergänzung zu große Überwachungssysteme. Es ermöglicht Erfassung und Analyse von Proben aus der ganzen Welt, ohne die Notwendigkeit zur Aufrechterhaltung einer Kühlkette oder Sicherheitsvorschriften in Bezug auf Transport von gefährlichen Reagenzien, wie Alkohol oder Guanidin.
Die hier beschriebene Protokoll stellt eine ergänzende Methode, um Fäkalien oder ähnlichen Proben auf das Vorhandensein von AIV Bildschirm. Es wurde speziell entwickelt, um die Probenentnahme schnell und einfach. Dies macht es möglich für weniger trainierte Personen, wie Jäger oder Wildtieren Manager, um AI-Überwachung beitragen. Keine Kühlketten angewendet werden müssen, obwohl das Einfrieren der Proben wird empfohlen, soweit möglich. Ein paar Tage bei Raumtemperatur, zum Beispiel während des Transports ins Labor, waren kein Problem für die RNA-Moleküle auf FTA-Karten, solange die Karten trocken blieb. Andere nicht gekühlt Storage-Systeme, die derzeit von der Forschungsgemeinschaft ausgewertet werden, wie Alkohol 15 oder Guanidin 16, erfordern besondere Vorkehrungen Versand wegen ihrer Gefährlichkeit. Im Gegensatz dazu wird die FTA-Karte-Verfahren nicht erforderlich, Versand von Gefahrgut. Allerdings ist ein weiteres interessantes Speichermedium in dieser Hinsicht RNAlater ™, ist nicht gefährlich, entweder 17. Beispiel Analyse kann in jedem Standard-molekularen Labor durchgeführt werden. Keine besondere Ausrüstung anders als für die üblichen PCR-Reaktionen und Kapillar-Sequenzierung wurde benötigt. Alle Schritte können ohne eine Sicherheitsstufe durchgeführt werden, da bereits bei der Probennahme die potenziellen Krankheitserregern durch die antibakterielle und antivirale Aktivität der FTA-Karte inaktiviert wurden.
Cross-Kontamination und anschließende falsch-positiven Proben wurden nicht in unsere Studien mit Wildvögeln Proben beobachtet. Doch bei der Arbeit mit RNA und PCR ist es immer ratsam, besondere Aufmerksamkeit zu schenken Arbeitsplätze und separate Räume für Pre-und Post-PCR-Schritte zu reinigen. Arbeiten in einem Abzug verringert das Risiko des Aerosol-Kontamination im Labor. Pipettieren muss mit Filterspitzen durchgeführt werden.
Von einer früheren Studie an Proben gleichzeitig über dieselbe Enten wissen wir, dass sechs der 84 Proben positiv waren von den traditionellen RealTime RT-PCR-Methode 24 und die CT-Werte von RealTime RT-PCR bekannt gemacht. Die beiden positiven Proben mit unserer Methode stammen von Enten, die Ct-Werte <30 (was auf eine hohe Konzentration von viraler RNA) aufgedeckt hatte. Die anderen vier Proben, die positiv mit dem traditionellen Protokoll waren, hatten Ct-Werte> 30 (weniger konzentriert) und nicht durch unser Protokoll erfasst werden.
Nur Proben mit relativ hoher Virustiter wurden in unserem Test positiv und es ist wahrscheinlich, dass die Empfindlichkeit des Verfahrens wird die Fehlerquelle zu allen positiven Proben nachzuweisen war. Ferner wurde die Stichprobengröße in der aktuellen Studie sehr gering und das Verfahren kann vollständig entwickelt und bewertet werden, wenn mehr kontrolliert und strenge Experimente durchgeführt werden. Allerdings, wenn diese Proben würden von einem abgelegenen Gebiet gesammelt worden sind, würde der traditionellen Analyse nicht möglich gewesen, zu haben. Darüber hinaus stammen diese ersten Ergebnisse aus Modellversuchen, die weitere Optimierung benötigen. Ein Zeitraum von zwei Jahren Lagerung in einem regelmäßigen -20 ° C Gefrierschrank nach Blutentnahme wahrscheinlich auch die Qualität der viralen RNA beeinflusst. Diese mögliche RNA-Abbaus ist ein wichtiges Thema beim Umgang mit Lagerung bei Raumtemperatur von inaktivierten Viren. Die Proben in alternative Flüssigkeiten gelagert, wie oben erwähnt leiden unter signifikanten Abbau der Analyse der längere Strecken des viralen Genoms 16 Auswirkungen. Obwohl in unserer Studie nicht getestet haben FTA-Karten nachweislich gut geeignet sein, um intakte RNA-Moleküle in anderen RNA-Systeme, die sehr ähnlich zu Avian Influenza-Viren 25, 26 sind erhalten.
The authors have nothing to disclose.
Wir bedanken uns bei Bert Dibbits für technische Unterstützung. Die Tierzucht und Genomics Group, Wageningen University, Niederlande, großzügig gehostet uns in ihrem Labor. Das Personal des Ottenby Bird Observatory, Schweden, ist zum Einfangen und Abtasten der Stockenten dankte, insbesondere Magnus Hellström, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson und Stina Andersson. Wir bedanken uns bei Sanne Svensson, Jonatan Qvist und Per-Axel Gjöres für die Dreharbeiten zu Ottenby und Mano Camon für Dreharbeiten in das Labor. Daniel Bengtson vorgesehen schöne Ente Fotos für das Video Teil dieser Publikation. Weitere freie Material aus dem CDC Public Health Image Library (PHIL; http://phil.cdc.gov/phil/ ) verwendet wurde: Die elektronenmikroskopische Aufnahme (Nr. 280; von Dr. Erskine Palmer) und Illustration (Nr. 11823; von Douglas Jordan) des Influenza-Virus. Finanzielle Unterstützung wurde durch die KNJV (Royal Netherlands Hunters Association), dem niederländischen Ministerium für Landwirtschaft, die Faunafonds und der Stichting de Eik Trusts (sowohl in den Niederlanden) angegeben, die schwedische Research Council (Grant No. 2007-20774) und der EG fundierte Newflubird Projekt. RNA-Isolierung Chemikalien wurden eine großzügige Schenkung von Ambion, Inc., die RNA-Unternehmen. Dies ist Beitrag Nr. 245 vom Ottenby Bird Observatory.
Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
FTA card | Whatman | several options | |
Harris micro punch 2mm with mat | Whatman | 1154409 | |
RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
One-Step Access RT-PCR system | Promega | A1250 | or comparable |
Agarose MP | Roche | 1388991001 | multi purpose agarose |
5x loading buffer | BioRad | delivered with DNA ladder | |
EZ load 100 bp ladder | BioRad | 170-8353 | or comparable |
Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | or comparable |
ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |