Un metodo per preservare, rilevare e sequenza di RNA da virus dell'influenza aviaria è stato convalidato ed esteso usando naturale campioni di feci di uccelli. Questa tecnica elimina la necessità di mantenere una catena del freddo e la manipolazione di virus infettivo e può essere applicato in un 96-e high-throughput di setup.
I virus dell'influenza aviaria (AIVs) infettare molti mammiferi, compresi gli esseri umani 1. Queste AIVs sono diversi nei loro ospiti naturali, l'ospitare quasi tutti i possibili sottotipi virali 2. Pandemie influenzali umani di origine derivano da AIVs 3. Molti casi mortali umani durante la focolai di H5N1 negli ultimi anni sono stati segnalati. Ultimamente, un nuovo ceppo AIV relativi attraversò la popolazione umana, causando 4 il 'epidemia di influenza suina'. Anche se di trading e dell'attività umana trasporto sembra essere responsabile della diffusione di ceppi altamente patogeni 5, la dispersione può anche essere in parte attribuito a uccelli selvatici 6, 7. Tuttavia, la riserva reale di tutti i ceppi AIV è uccelli selvatici.
In reazione a questo e di fronte alle gravi perdite commerciali nel settore del pollame, i programmi di sorveglianza di grandi dimensioni sono stati implementati a livello globale per raccogliere informazioni sull'ecologia di AIVs, e di installare sistemi di allarme rapido per rilevare alcuni ceppi altamente patogeni 8-12. I metodi tradizionali di virus virologica richiedono di essere integro e coltivato prima dell'analisi. Ciò richiede rigorosa catena del freddo con congelatori e pesanti le procedure di biosicurezza essere a posto durante il trasporto. A lungo termine di sorveglianza è quindi di solito limitata ad una delle stazioni di campo di alcuni stretti ai laboratori ben attrezzati. Aree remote non possono essere oggetto di campionamento a meno che le procedure logisticamente complicato l'attuazione. Questi problemi sono stati riconosciuti 13, 14 e l'utilizzo dello stoccaggio e strategie alternative di trasporto indagato (alcoli o guanidina) 15-17. Recentemente, Kraus et al. 18 ha introdotto un metodo per raccogliere, immagazzinare e trasportare campioni di AIV, basato su una carta speciale filtro. FTA 19 carte preservare l'RNA su una base di stoccaggio a secco 20 e rendere inattivi gli agenti patogeni a contatto 21. Questo studio ha dimostrato che le carte FTA può essere utilizzato per rilevare AIV RNA in PCR di trascrizione inversa e che il cDNA risultante potrebbe essere sequenziato i geni del virus e determinato.
Nello studio di Kraus et al. 18 un laboratorio isolato di AIV è stato utilizzato, ei campioni sono stati trattati singolarmente. Nella estensione qui presentata, campioni di feci di volatili selvatici dalla trappola d'anatra al Uccello Ottenby Observatory (SE Svezia) sono stati testati direttamente per illustrare l'utilità dei metodi in condizioni reali. Cattura di anatre e raccolta dei campioni da tamponi cloacali è dimostrata. Il protocollo attuale prevede up-scaling del flusso di lavoro dalla gestione singolo tubo di un design a 96 pozzetti. Anche se meno sensibili rispetto ai metodi tradizionali, il metodo di FTA carte offre un ottimo complemento ai sistemi di sorveglianza di grandi dimensioni. Esso consente la raccolta e l'analisi di campioni provenienti da ogni parte del mondo, senza la necessità di mantenimento di una catena fredda o norme di sicurezza rispetto alla spedizione di reagenti pericolosi, come l'alcool o guanidina.
Il protocollo qui descritto fornisce un metodo supplementare per lo screening dei campioni fecali o simili per la presenza di AIV. E 'stato appositamente studiato per rendere la raccolta del campione rapido e facile. Questo rende possibile per le persone meno allenati, come cacciatori o gestori della fauna selvatica, per contribuire alla sorveglianza AI. Nessuna catena fresco devono essere applicate, anche se il congelamento dei campioni è consigliabile, ove possibile. Pochi giorni di temperatura ambiente, per esempio durante il trasporto al laboratorio, non erano un problema per le molecole di RNA su schede FTA, fino a quando le carte sono rimasti a secco. Altri non raffreddato sistemi di storage che sono attualmente valutati dalla comunità di ricerca, come l'alcool 15 o guanidina 16, richiedono particolari modalità di spedizione a causa della loro natura pericolosa. Al contrario, il metodo della carta FTA non richiede spedizione di materiali pericolosi. Tuttavia, un altro supporto di memorizzazione interessante a questo riguardo è RNAlater ™ che non è pericoloso, sia 17. Analisi dei campioni può essere effettuata in qualsiasi standard di laboratorio molecolare. Nessuna attrezzatura speciale diverso dal solito per reazioni di PCR e il sequenziamento capillare era necessario. Tutte le fasi potrebbe essere effettuata senza un livello di biosicurezza perché già al momento della raccolta dei campioni di agenti patogeni potenziali sono stati inattivati dalla attività antibatterica e antivirale della carta FTA.
Contaminazione incrociata e successive campioni falsi positivi non sono stati osservati nelle nostre prove con campioni di uccelli selvatici. Tuttavia, quando si lavora con l'RNA e PCR è sempre consigliabile prestare particolare attenzione per la pulizia dei luoghi di lavoro e stanze separate per le fasi pre-e post-PCR. Lavorare in una cappa aspirante diminuisce il rischio di contaminazione da aerosol in laboratorio. Pipettaggio deve essere effettuata con puntali con filtro.
Da uno studio precedente su campioni prelevati simultaneamente dal anatre stessa sappiamo che sei dei 84 campioni sono risultati positivi con il tradizionale RealTime RT-PCR 24 e i valori di Ct da RealTime RT-PCR sono noti. I due campioni positivi rilevati dal nostro staminali metodo di anatre che erano i valori Ct <30 (che indica una alta concentrazione di RNA virale). Gli altri quattro campioni sono risultati positivi con il protocollo tradizionale aveva valori Ct> 30 (meno concentrato) e non potrebbe essere rilevato dal nostro protocollo.
Campioni solo con titoli di virus relativamente alta sono risultati positivi nel nostro test ed è probabile che la sensibilità del metodo è stata la fonte di mancato riconoscimento di tutti i campioni positivi. Inoltre, la dimensione del campione in questo studio era molto bassa e il metodo può essere completamente sviluppato e valutato se gli esperimenti più controllata e rigorosa vengono effettuate. Tuttavia, se questi campioni sarebbero stati raccolti da una zona remota, l'analisi tradizionali non sarebbe stato possibile a tutti. Inoltre, questi primi risultati derivano da esperimenti pilota che hanno bisogno di un'ulteriore ottimizzazione. Un periodo di due anni in un deposito regolare congelatore -20 ° C dopo la raccolta del campione, probabilmente influenzato anche la qualità del RNA virale. Questa degradazione dell'RNA possibile è una questione importante quando si tratta di stoccaggio a temperatura ambiente di virus inattivati. Campioni conservati nei liquidi alternativa come detto sopra soffrono di un notevole degrado che incide di più si estende l'analisi del genoma virale 16. Anche se non testati nel nostro studio, le carte FTA hanno dimostrato di essere adatto a preservare intatto molecole di RNA in altri sistemi di RNA che sono molto simili ai virus dell'influenza aviaria, 25, 26.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Dibbits Bert per assistenza tecnica. L'allevamento degli animali e il Gruppo Genomica, Università di Wageningen, Paesi Bassi, generosamente ci ha ospitato nel loro laboratorio. Il personale del Uccello Ottenby Observatory, in Svezia, si ringrazia per la cattura e il campionamento dei germani reali, in particolare Hellström Magnus, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson e Stina Andersson. Ringraziamo Sanne Svensson, Jonatan Qvist e Per-Axel Gjöres per riprese a Ottenby, e Mano Camon per le riprese in laboratorio. Daniel Bengtson fornito fotografie anatra bello per la parte video di questa pubblicazione. Ulteriore materiale libero da la Biblioteca immagine CDC pubblica (PHIL; http://phil.cdc.gov/phil/ ) è stato utilizzato: il microscopio elettronico (n. 280; dal Dott. Erskine Palmer) e illustrazione (n. 11823; da Douglas Giordania) del virus dell'influenza. Il sostegno finanziario è stato dato dal KNJV (Royal Paesi Bassi Hunters Association), il Ministero olandese dell'Agricoltura, della Faunafonds e la Stichting de Trusts Eik (sia in Olanda), il Consiglio svedese della ricerca (Grant no. 2007-20774) e la CE -fondato Newflubird progetto. Prodotti chimici isolamento di RNA sono stati un dono generoso di Ambion, Inc, l'azienda RNA. Questo è il contributo n. 245 dal Bird Ottenby Osservatorio.
Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
FTA card | Whatman | several options | |
Harris micro punch 2mm with mat | Whatman | 1154409 | |
RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
One-Step Access RT-PCR system | Promega | A1250 | or comparable |
Agarose MP | Roche | 1388991001 | multi purpose agarose |
5x loading buffer | BioRad | delivered with DNA ladder | |
EZ load 100 bp ladder | BioRad | 170-8353 | or comparable |
Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | or comparable |
ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |