Метод сохранения, выявления и последовательность РНК из вирусов птичьего гриппа была подтверждена и расширенного использования природных образцах помета от птиц. Эта техника устраняет необходимость поддержания прохладно цепи и обработки инфекционных вирусов и может применяться в 96-и высокую пропускную способность установки.
Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the ‘swine flu epidemic’4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.
Протокол, описанный здесь, обеспечивает дополнительный метод для выявления фекального или аналогичных образцов на наличие ВГП. Он был специально разработан, чтобы сделать пробы быстро и легко. Это дает возможность для менее образованных лиц, например, охотники или диких животных, менеджеров, внести свой вклад в наблюдение AI. Нет прохладный цепи должны применяться, хотя и замораживания образцов рекомендуется там, где это возможно. Несколько дней комнатной температуре, например, во время транспортировки в лабораторию, не были проблемой для молекул РНК на картах FTA тех пор, пока карты остались сухими. Прочие охлаждение систем хранения данных, которые в настоящее время оцениваются научным сообществом, таких как алкоголь 15 или гуанидина 16, требуют специальных механизмов доставки из-за их опасный характер. В отличие от метода FTA карта не требует перевозки опасных материалов. Тем не менее, еще один интересный носитель в этом отношении является RNAlater ™, которые не являются опасными, либо 17. Анализ проб может быть осуществлена в любой стандартной молекулярной лаборатории. Никакого специального оборудования, кроме обычного для реакции ПЦР и секвенирования капиллярной было необходимо. Все шаги могут быть осуществлены без уровень биобезопасности, потому что уже на пробы потенциальных патогенных агентов были инактивируется антибактериальной и противовирусной активности карта FTA.
Перекрестного загрязнения и последующего ложных положительных образцов не наблюдалось в наших исследованиях с дикими образцы птицы. Однако при работе с РНК и ПЦР всегда целесообразно обратить особое внимание на чистые рабочие места и отдельные комнаты для пред-и пост-ПЦР шагов. Работа в вытяжной шкаф снижает риск аэрозольного загрязнения в лаборатории. Пипетирование должна осуществляться с фильтром советы.
Из предыдущих исследований на образцах, взятых одновременно из одной утки мы знаем, что шесть из 84 образцов были положительными по традиционной RealTime RT-PCR метод 24 и Ct значения от RealTime RT-PCR известны. Два положительных образцах обнаружены нашего метода вытекают из утки которая Ct значения <30 (что указывает на высокую концентрацию вирусной РНК). Других четырех образцов, которые были положительны с традиционным протоколом, Ct значения> 30 (менее концентрированный) и не могли быть обнаружены с помощью нашего протокола.
Только образцы с относительно высоким титром вируса были положительными в нашем анализе, и вполне вероятно, что чувствительность метода была источником неспособность обнаружить все положительные пробы. Кроме того, размер выборки в данном исследовании была очень низкой, и метод может быть полностью разработаны и оценены, если более контролируемой и строгие эксперименты проводятся. Однако, если эти образцы были бы собраны из отдаленной местности, традиционного анализа не было бы вообще возможно. Кроме того, эти первые результаты обусловлены пилот эксперименты, которые нуждаются в дальнейшей оптимизации. Течение двух лет хранения в обычном -20 ° C морозильник после пробы, вероятно, также повлияло на качество вирусной РНК. Это возможно снижение РНК является важной проблемой при работе с комнатной температуре хранения инактивированных вирусов. Образцы хранятся в альтернативных жидкостей, как упоминалось выше страдают от значительного снижения, который влияет анализ больше участков вирусного генома 16. Хотя это и не проверены в нашем исследовании, открыто карты оказались хорошо подходит для сохранения интактных молекул РНК в других системах РНК, которые очень похожи на вирусы птичьего гриппа 25, 26.
The authors have nothing to disclose.
We thank Bert Dibbits for technical assistance. The Animal Breeding and Genomics Group, Wageningen University, The Netherlands, generously hosted us in their laboratory. The personnel of the Ottenby Bird Observatory, Sweden, is thanked for trapping and sampling the mallards, in particular Magnus Hellström, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson and Stina Andersson. We thank Sanne Svensson, Jonatan Qvist and Per-Axel Gjöres for filming at Ottenby, and Mano Camon for filming in the lab. Daniel Bengtson provided beautiful duck photographs for the video portion of this publication. Further free material from the CDC Public Health Image Library (PHIL; http://phil.cdc.gov/phil/) was used: The electron micrograph (no. 280; by Dr. Erskine Palmer) and illustration (no. 11823; by Douglas Jordan) of the influenza virus. Financial support was given by the KNJV (Royal Netherlands Hunters Association), the Dutch Ministry of Agriculture, the Faunafonds and the Stichting de Eik Trusts (both in The Netherlands), the Swedish Research Council (grant no. 2007-20774) and the EC-founded Newflubird project. RNA isolation chemicals were a generous gift of Ambion, Inc, the RNA company. This is contribution No. 245 from the Ottenby Bird Observatory.
Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
FTA card | Whatman | several options | |
Harris micro punch 2mm with mat | Whatman | 1154409 | |
RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
One-Step Access RT-PCR system | Promega | A1250 | or comparable |
Agarose MP | Roche | 1388991001 | multi purpose agarose |
5x loading buffer | BioRad | delivered with DNA ladder | |
EZ load 100 bp ladder | BioRad | 170-8353 | or comparable |
Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | or comparable |
ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |