조류 독감 바이러스의 RNA를 보존 감지하고 순서 방법 확인과 조류의 자연 faecal 샘플을 사용하여 확장되었습니다. 이 기술은 시원한 체인 및 전염성 바이러스의 취급을 유지의 필요성을 제거하고 96 – 웰 높은 처리량 설치에 적용할 수 있습니다.
조류 독감 바이러스 (AIVs)는 인간이 하나 등 많은 포유 동물을 감염. 이러한 AIVs 거의 모든 가능한 바이러스 subtypes 2 품고 그들의 자연적인 호스트로 다양합니다. 독감의 인간 전염병은 원래 AIVs 3 줄기. 최근에 H5N1 발생하는 동안 많은 치명적인 인간의 환자가보고되었다. 최근, 새로운 AIV 관련 변종은 '신종 인플루엔자의 유행'4 유발, 인간의 인구를 휩쓸고. 인간의 무역과 운송 활동이 높은 병원성 종자 5의 확산에 대한 책임 것으로 보인다 있지만, 분산도 일부 야생 조류 6, 7에 의한 수 있습니다. 그러나 모든 AIV 종자의 실제 저수지 야생 조류입니다.
이것과 가금류 산업에 심각한 상업적인 손실의 얼굴에 대한 반응으로, 대형 감시 프로그램은 AIVs의 생태에 대한 정보를 수집하고, 특정 고도의 병원성 변종 8-12을 감지하는 조기 경보 시스템을 설치하는 세계적으로 구현되었습니다. 전통 virological 방법은 바이러스가 온전하고 분석하기 전에 재배가 필요합니다. 이것은 깊은 냉동고 및 수송 동안에있을 무거운 biosafety 절차와 엄격한 감기에 사슬을 요구. 장기 감시 따라서 일반적으로 잘 갖추어진 실험실에 가까운 몇 가지 필드 방송국에 제한됩니다. logistically 성가신 절차를 구현하지 않는 원격 영역은 샘플 수 없습니다. 이러한 문제는 13 인정, 14, 대체 저장소 및 운송 전략의 사용 (알콜이나 구아니딘) 15-17를 조사하고 있습니다. 최근 크라우스 외. 18 특수 여과지에 따라 수집하는 방법, 저장 및 전송 AIV 샘플을 소개했다. FTA 카드 19 건조 저장 기준 20 RNA를 보존 및 연락처 21시 비활성 병원균을 렌더링합니다. 이 연구는 FTA 카드 리버스 전사 PCR과 결과 cDNA가 합성 및 바이러스 유전자와 결정 될 수 AIV RNA를 감지하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났다.
AIV가 사용되었고, 샘플 개별적으로 처리했는지 크라우스 외. 18 연구에서는 실험실 격리. 여기에 제시 확장에 Ottenby 버드 천문대 (SE 스웨덴)에서 오리 트랩에서 야생 조류에서 faecal 샘플은 현장 조건에 따라 방법의 유용성을 설명하기 위해 직접 테스트했다. cloacal 면봉으로 오리 및 샘플 수집 잡는 것은 증명합니다. 현재 프로토콜은 하나의 튜브 처리에서 96 잘 설계 작업 흐름의 최대 – 스케일링을 포함합니다. 전통적인 방법보다 민감하지만, FTA 카드의 방법은 대형 감시 제도에 대한 훌륭한 보완을 제공합니다. 그것은 알코올이나 구아니딘 같은 위험한 시약의 운송과 관련하여 시원한 체인 또는 안전 규정을 유지하기 위해 필요없이 어디서나 세계에서 샘플의 수집과 분석이 가능합니다.
여기에서 설명한 프로토콜은 AIV의 존재를 faecal 또는 유사한 샘플을 화면으로 보충 방법을 제공합니다. 이것은 특히 샘플 수집 빠르고 쉽게하도록 설계되었습니다. 이렇게하면 같은 사냥꾼이나 야생 동물의 관리자로서 적은 훈련 명, AI 감시에 기여 할 수 있습니다. 가능한 샘플을 냉동 것은 권장하지만 아무도 시원한 체인은 적용할 필요가 없습니다. 실온의 며칠 예를 들어 실험실로 이송하는 동안, 카드 건조 남아만큼, FTA 카드에서 RNA 분자에 대한 문제가되지 않았습니다. 이러한 알코올 15 구아니딘 16로 현재 연구 공동체에 의해 평가하는 다른 비 냉각 저장 시스템은, 때문에 그들의 유해 자연의 특별 운송 계약이 필요합니다. 반면, FTA 카드 방식은 유해 물질의 전달을 요구하지 않습니다. 그러나, 이러한 측면에서 또 다른 흥미로운 저장 매체는 17도 위험이 아니라고 RNAlater ™입니다. 샘플 분석은 어떤 표준 분자 연구실에서 진행하실 수 있습니다. 일반적인 PCR 반응 및 모세관 배열 이외의 특별한 장비는 필요 없었습니다. 이미 샘플 컬렉션에있는 잠재적인 병원성 대리인이 FTA 카드의 항균 및 항바이러스 활동에 의해 inactivated 있었기 때문에 모든 단계 biosafety 수준없이 진행 될 수 있습니다.
교차 오염 및 그 이후의 거짓 긍정적인 표본은 야생 조류 샘플의 실험에서 관찰되지 않았습니다. 그러나, RNA 및 PCR 작업했을 때 사전 및 사후 PCR 단계 작업 장소와 별도의 객실을 청소 특별한주의를 지불하는 것이 좋습니다. 펌 후드에 근무하는 실험실에서 에어로졸 오염의 위험을 감소시킵니다. Pipetting 필터 팁을 진행해야합니다.
우리가 84 샘플의 여섯 전통 RealTime에 의해 RT – PCR 방법 24 RealTime을 RT – PCR에서 CT 값이 알려져있다 긍정적인 것을 알고있는 동일한 오리에서 동시에 촬영한 샘플에 대한 이전의 연구에서. CT 값 <30 (바이러스 RNA의 높은 농도를 나타내는)했다 오리에서 우리의 방법의 줄기에 의해 감지 두 가지 긍정적인 샘플. 전통적인 프로토콜로 긍정적인하던 나머지 네 가지 예제> 30 일 (이하 집중)와 우리의 프로토콜에 의해 감지되지 않았습니다 CT 값을했다.
상대적으로 높은 바이러스 titers만이 샘플의 분석에 긍정적인되었으며 그것은 방법의 감도는 모든 긍정적인 샘플을 감지하는 실패의 원인이라고 가능성이 높습니다. 또한, 현재 연구의 표본 크기가 매우 낮은 경우 더 많은 통제와 엄격한 실험을 수행하는 경우 메서드는 완전히 개발 및 평가 수 있습니다. 이 샘플은 원격 지역에서 수집했을 경우에는, 전통적인 분석이 전혀 불가능되지 않았을 것입니다. 또한 이러한 첫번째 결과 더 최적화가 필요 파일럿 실험에서 줄기. 샘플 수집 후 정기적으로 -20 ° C의 냉장고에서 2 년간의 저장 기간은 아마도 또한 바이러스 RNA의 품질에 영향을. inactivated 바이러스의 상온 저장을 상대할 때는이 가능한 RNA 저하가 중요한 문제입니다. 상기와 같은 다른 액체에 저장된 샘플은 바이러스 게놈 16 이상 펼쳐진 분석 영향을 크게 저하의 고통. 우리의 연구에 테스트하지 않지만, FTA 카드는 물론 조류 독감 바이러스 25, 26 매우 유사한 다른 RNA 시스템에 그대로 RNA 분자를 보존하기 위해 적합한 것으로 입증했습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 기술 지원 버트 Dibbits 감사합니다. 동물 사육 및 게놈 그룹, Wageningen 대학, 네덜란드, 아낌없이 자신의 실험실에서 우리를 열었다. Ottenby 버드 천문대, 스웨덴의 직원은 특정 매그너스 Hellström, 마커스 Danielsson, 크리스토퍼 매그너슨 및 Stina 앤더슨에 맬러즈 트래핑 및 샘플링에 대한 감사입니다. 우리는 실험실에서 촬영을위한 Sanne 스벤슨, Jonatan Qvist 및 Ottenby에서 촬영을 위해 당 엑셀 Gjöres, 그리고 마노 Camon 감사드립니다. 다니엘 Bengtson이 간행물의 비디오 부분에 대한 아름다운 오리 사진을 제공했습니다. CDC 보건 이미지 라이브러리 (필,에서 자유 자재 http://phil.cdc.gov/phil/는 ) 사용 되었음 : 전자 현미경 (제 280; 박사 어스킨 팔머에 의해)와 그림 (제 11823을; 인플루엔자 바이러스의 더글러스 요르단)에 의해. 재정 지원은 KNJV (로얄 네덜란드 사냥꾼 협회), 농업의 네덜란드 교육부, Faunafonds과에는 Stichting 드 Eik 트러스트 (모두 네덜란드)에 의해 주어진 것으로 스웨덴 연구 협의회 (부여 안돼. 2007-20774)과 EC Newflubird 프로젝트 설립. RNA 격리 화학 물질 앰비온, Inc의 RNA 회사의 후한 선물했다. 이것은 Ottenby 버드 천문대에서 기여 번호 245입니다.
Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
FTA card | Whatman | several options | |
Harris micro punch 2mm with mat | Whatman | 1154409 | |
RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
One-Step Access RT-PCR system | Promega | A1250 | or comparable |
Agarose MP | Roche | 1388991001 | multi purpose agarose |
5x loading buffer | BioRad | delivered with DNA ladder | |
EZ load 100 bp ladder | BioRad | 170-8353 | or comparable |
Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | or comparable |
ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |