Um método para preservar, detectar e seqüência de RNA a partir de vírus da gripe aviária foi validado e estendido usando naturais amostras de fezes de pássaros. Esta técnica elimina a necessidade de manter uma corrente fria e manipulação de vírus infeccioso e podem ser aplicados em uma instalação de 96 poços de alto rendimento.
Vírus da gripe aviária (AIVs) infectar muitos mamíferos, incluindo seres humanos 1. Estes AIVs são diferentes em seus hospedeiros naturais, abrigando quase todos os possíveis subtipos virais 2. As pandemias de gripe humana originalmente derivam AIVs 3. Muitos casos humanos fatais durante os surtos de H5N1 nos últimos anos foram relatados. Ultimamente, uma cepa nova AIV relacionadas varreu a população humana, causando quatro a 'epidemia de gripe suína ". Apesar de a negociação humanos e atividade de transporte parece ser responsável pela disseminação de cepas altamente patogênicas 5, a dispersão também pode ser parcialmente atribuída a aves selvagens 6, 7. No entanto, o reservatório real de todas as cepas AIV é aves selvagens.
Em reação a isso e em face de graves perdas comerciais na indústria avícola, programas de vigilância de grande porte têm sido implementadas globalmente para coletar informações sobre a ecologia das AIVs, e instalar sistemas de alerta precoce para detectar certas cepas altamente patogênicas 8-12. Métodos tradicionais requerem virológica vírus para estar intacto e cultivadas antes da análise. Isto exige estrita cadeias de frio, com freezers e procedimentos de biossegurança pesada de estar no lugar durante o transporte. Vigilância de longo prazo é, portanto, normalmente restrita a um campo de poucos postos de perto de laboratórios bem equipados. Áreas remotas não podem ser amostrados a menos procedimentos logisticamente complicado são implementadas. Estes problemas foram reconhecidos 13, 14 e o uso de armazenamento e estratégias alternativas de transporte investigados (álcoois ou guanidina) 15-17. Recentemente, Kraus et al. 18 introduziu um método para coletar, armazenar e transportar amostras AIV, com base em um papel filtro especial. FTA cards 19 preservar RNA em uma base de armazenamento seco 20 e tornar inativa patógenos em contato 21. Este estudo mostrou que os cartões FTA pode ser usado para detectar AIV RNA na transcrição reversa-PCR e que o cDNA resultante poderia ser seqüenciado e genes de vírus e determinada.
No estudo de Kraus et al. 18 um laboratório isolado de AIV foi usado, e as amostras foram tratadas individualmente. Na extensão aqui apresentados, as amostras de fezes de aves selvagens da armadilha pato no pássaro Ottenby Observatory (SE Suécia) foram testadas diretamente para ilustrar a utilidade dos métodos em condições de campo. Captura de patos e coleta de amostras de swab cloacal é demonstrada. O protocolo atual inclui up-scaling do fluxo de trabalho de manipulação de tubo único para um projeto de 96 poços. Embora menos sensível do que os métodos tradicionais, o método de FTA cards fornece um excelente complemento para sistemas de vigilância de grande porte. Ele permite a coleta e análise de amostras de qualquer lugar do mundo, sem a necessidade de manutenção de uma cadeia fria ou normas de segurança no que diz respeito ao transporte de reagentes perigosos, como o álcool ou guanidina.
O protocolo aqui descrito fornece um método complementar para a tela amostras fecais ou similar para a presença de AIV. Foi especialmente projetado para fazer coleta de amostras rápida e fácil. Isto torna possível para as pessoas menos treinados, como caçadores ou gerentes dos animais selvagens, para contribuir para a vigilância AI. Sem correntes legal precisam ser aplicadas, embora o congelamento das amostras é recomendado sempre que possível. A poucos dias de temperatura ambiente, por exemplo durante o transporte para o laboratório, não foram um problema para as moléculas de RNA em cartões FTA, enquanto os cartões permaneceu seco. Outros sistemas não-refrigerado de armazenamento que estão atualmente avaliadas pela comunidade de pesquisa, como o álcool de 15 ou 16 de guanidina, exigem arranjos especiais de transporte devido à sua natureza perigosa. Em contraste, o método do cartão FTA não requer o transporte de materiais perigosos. No entanto, outro meio de armazenamento interessante a esse respeito é RNAlater ™ que não é perigoso, ou 17. Análise da amostra pode ser realizada em qualquer laboratório padrão molecular. Nenhum equipamento especial que não seja usual para as reações PCR e seqüenciamento capilar foi necessário. Todas as etapas poderiam ser realizadas sem um nível de biossegurança, pois já na coleta de amostra do potencial de agentes patogênicos foram inativadas pela atividade antibacteriana e antiviral do cartão FTA.
Contaminação cruzada e subsequente amostras com falsos positivos não foram observados em nossos ensaios com amostras de aves selvagens. No entanto, quando se trabalha com RNA e PCR é sempre aconselhável prestar atenção especial para limpar locais de trabalho e salas separadas para as etapas pré e pós-PCR. Trabalhando em um exaustor diminui o risco de contaminação de aerossóis no laboratório. Pipetagem precisa ser realizado com pontas com filtro.
A partir de um estudo anterior em amostras colhidas simultaneamente a partir do patos mesmo sabemos que seis das 84 amostras foram positivas pela RealTime tradicional método de RT-PCR 24 e os valores de Ct RealTime RT-PCR são conhecidos. As duas amostras positivas detectadas pelos nossos tronco método de patos que tinham valores Ct <30 (indicando uma alta concentração de RNA viral). As outras quatro amostras que foram positivas com o protocolo tradicional tinha valores Ct> 30 (menos concentrada) e não poderia ser detectado por nosso protocolo.
Apenas amostras de vírus com títulos relativamente altos foram positivos em nosso ensaio e é provável que a sensibilidade do método foi a fonte de falha para detectar todas as amostras positivas. Além disso, o tamanho da amostra do presente estudo foi muito baixa eo método pode ser completamente desenvolvida e avaliada se mais experimentos controlados e rigorosos são realizados. No entanto, se estas amostras teriam sido coletados de uma área remota, a análise tradicional não teria sido possível a todos. Além disso, esses primeiros resultados derivam de experiências-piloto que necessitam de otimização. Um período de dois anos de armazenamento em freezer -20 ° C regulares após a coleta da amostra, provavelmente, também afetou a qualidade do RNA viral. Esta degradação RNA possível é uma questão importante quando se lida com o armazenamento em temperatura ambiente de vírus inativado. Amostras armazenadas em líquidos alternativos, como mencionado acima sofrem de significativa degradação que afeta a análise de trechos mais longos do genoma viral 16. Apesar de não ser testado em nosso estudo, cartões FTA provaram ser bem adequada para preservar as moléculas de RNA intactas em outros sistemas de RNA, que são muito semelhantes aos vírus da gripe aviária 25, 26.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Dibbits Bert para assistência técnica. O Grupo de Melhoramento Animal e Genomics, Universidade de Wageningen, Holanda, generosamente acolhido nos seus laboratórios. O pessoal do Pássaro Ottenby Observatory, na Suécia, é agradeceu captura e amostragem do marreco, em especial Hellström Magnus, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson e Stina Andersson. Agradecemos a Sanne Svensson, Jonatan Qvist e Per-Axel Gjöres para filmar em Ottenby, e Mano Camon para filmar no laboratório. Daniel Bengtson desde fotografias de pato bonito para a parte de vídeo dessa publicação. Material livre mais longe da Biblioteca de Imagens CDC de Saúde Pública (PHIL; http://phil.cdc.gov/phil/ ) foi usada: A micrografia eletrônica (n º 280; pelo Dr. Erskine Palmer) e ilustração (n º 11.823; por Douglas Jordan) do vírus influenza. O apoio financeiro foi dado pelo KNJV (Royal Holanda Hunters Association), o Ministério Holandês da Agricultura, o Faunafonds ea Stichting Trusts de Eik (ambos na Holanda), o sueco Research Council (não concedem. 2007-20774) e da CE -fundada Newflubird projeto. Produtos químicos de isolamento de RNA foram um presente generoso de Ambion, Inc, a empresa RNA. Esta é a contribuição n ° 245 do Pássaro Ottenby Observatory.
Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
FTA card | Whatman | several options | |
Harris micro punch 2mm with mat | Whatman | 1154409 | |
RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
One-Step Access RT-PCR system | Promega | A1250 | or comparable |
Agarose MP | Roche | 1388991001 | multi purpose agarose |
5x loading buffer | BioRad | delivered with DNA ladder | |
EZ load 100 bp ladder | BioRad | 170-8353 | or comparable |
Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | or comparable |
ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |