维护,检测和序列禽流感病毒的RNA的方法进行了验证和扩展,从鸟类的自然粪便样本。这种技术消除了保持冷静的链和处理传染性病毒的必要性和可应用在一个96孔高通量设置。
感染禽流感病毒(AIVs)的许多哺乳动物,包括人类在内的 1 。这些AIVs是多种多样的,在其自然宿主,窝藏几乎所有可能的病毒亚型。人类的流感大流行最初来源于AIVs 3。许多致命的H5N1疫情在近年的人类感染病例的报道。最近,一个新的禽流感病毒相关的应变席卷整个人类的人口,造成“猪流感疫情”4 。虽然人类的贸易和运输活动,似乎是负责的高致病性菌株 5的传播,扩散也可以部分归因于野生鸟类6, 7。然而,所有禽流感病毒株的实际水库的野生鸟类。
在反应和家禽业面临严重的商业损失,已实施了大型监视计划在全球范围内收集信息,对生态AIVs安装预警系统,以检测某些高致病性菌株8-12。传统的病毒学方法要求病毒和分析前是完好的耕地。深冷冻机和沉重的生物安全程序到位,在运输过程中必须严格的冷链。长期监测,因此通常仅限于几个场站,装备精良的实验室。偏远地区无法进行采样,除非实施后勤手续繁琐。这些问题已经被公认为13,14和使用替代的储存和运输策略调查(醇类或胍)15-17 。最近,克劳斯等 18介绍的方法收集,储存和运输的禽流感病毒样本,基于一个特殊的滤纸。 FTA卡19保存在干燥的存储基础20 RNA和渲染病原体接触后21日无效。这项研究表明,FTA卡可以用来检测禽流感病毒的RNA在反转录PCR,可能是导致基因测序,病毒的基因,并确定。
在克劳斯等人 18的研究在实验室分离出禽流感病毒,并单独处理样品。在这里介绍的扩展,从Ottenby鸟天文台(SE瑞典)鸭陷阱野生鸟类的粪便样本进行了测试,直接说明了野战条件下的方法的实用性。捉鸭和泄殖腔拭子样品的采集是证明。目前的协议,包括从单管处理96井设计的工作流程缩放。虽然比传统方法敏感,FTA卡的方法提供了一个优良的大型监控计划的补充。它可以在世界任何地方的样本收集和分析,而不需要保持阴凉链或有害试剂,如酒精或胍,航运方面的安全法规。
这里描述的协议提供了一个辅助方法,以屏幕为禽流感病毒的存在的粪便或类似的样品。这是特别设计,使样品采集的快速和容易。这使得它较少受过训练的人员,如猎人或野生动物管理人员,可能有助于对禽流感监测。无冷却链需要应用,虽然冻结的样品,建议在可能的情况下。室温几天,例如在运输过程中的实验室,是没有问题的FTA卡上的RNA分子,只要卡保持干燥。其他非冷却储存系统,目前正在研究社会评价,如酒精 15或胍 16日,需要特殊的运输安排,因为其危险性质。相比之下,FTA卡法不需要有害物质的航运。然而,在这方面的另一个有趣的存储介质是RNAlater™是没有危险的,无论是17。样品分析,可以在任何标准的分子实验室进行。没有特殊的设备比其他常规的PCR反应和毛细管测序是必要的。所有步骤都可以进行无生物安全级别,因为已经在样本收集潜在的病原体灭活FTA卡的抗菌和抗病毒活性。
在我们的试验与野生鸟类标本的交叉污染和随后的假阳性样品,没有观察到。然而,RNA和PCR时,它始终是最好要特别注意清洁前和后的PCR步骤的工作场所和单独的房间。在通风橱中工作,减少在实验室中的气溶胶污染的风险。移液需要进行过滤嘴。
从先前的研究同时从我们知道的84个样本中有6个是由传统的实时RT – PCR法24和 实时RT – PCR检测的Ct值是已知的相同的鸭的样本。我们的Ct值<30(显示高浓度的病毒RNA)的方法从鸭干检测的阳性标本。其他4个样本,与传统的协议的积极的Ct值> 30(不集中)和不能被检测到我们的协议。
只有具有比较高的病毒滴度的样品呈阳性,在我们的实验和方法的灵敏度,很可能是故障检测所有阳性标本的来源。此外,在目前的研究的样本量非常低,该方法可以完全开发和评估,如果进行更多的控制和严格的实验。但是,如果这些样本将被从一个偏远地区收集,传统的分析不会已经有可能在所有。此外,这些结果源于试点实验,需要进一步优化。定期-20℃冷冻样品采集后的一两年的存储期间也可能影响病毒RNA的质量。这种可能的RNA降解是一个重要的问题,处理与灭活病毒的房间温度存储时。替代液体储存上述样品遭受显着降低,从而影响分析不再延伸的病毒基因组的 16 。虽然没有在我们的研究测试,FTA卡已被证明是适合保存在其他RNA系统是非常相似的禽流感病毒,25,26的,完整的RNA分子。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢伯特Dibbits技术援助。动物育种和基因组,瓦赫宁根大学,荷兰,慷慨地在他们的实验室主办。 ,瑞典,Ottenby鸟天文台的工作人员表示感谢,诱捕和取样的绿头鸭,特别是马格努斯Hellström,马库斯 – 丹尼尔森,马格努松克里斯蒂娜安德森。我们感谢Jonatan Qvist桑妮斯文森,并在Ottenby拍摄的每阿克塞尔Gjöres,和马诺Camon在实验室内进行拍摄。丹尼尔Bengtson提供本出版物的视频部分美丽的鸭照片。使用,进一步加强疾病预防控制中心公共卫生图片库(PHIL ;材料http://phil.cdc.gov/phil/):电子显微镜(280号;厄斯金帕尔默博士)和插图(第11823;道格拉斯约旦)的流感病毒。财政支持KNJV(荷兰皇家猎人协会),荷兰农业部,Faunafonds的STICHTING Eik信托(在荷兰),瑞典研究理事会(赠款。2007-20774)和欧共体创办Newflubird项目。 RNA提取的化学品,RNA公司Ambion公司,公司的一个厚礼。这是第245号从Ottenby鸟天文台的贡献。
Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
FTA card | Whatman | several options | |
Harris micro punch 2mm with mat | Whatman | 1154409 | |
RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
One-Step Access RT-PCR system | Promega | A1250 | or comparable |
Agarose MP | Roche | 1388991001 | multi purpose agarose |
5x loading buffer | BioRad | delivered with DNA ladder | |
EZ load 100 bp ladder | BioRad | 170-8353 | or comparable |
Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | or comparable |
ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |