鳥インフルエンザウイルスから守るための方法、検出し、シーケンスのRNAは、検証され、鳥類から自然な糞便サンプルを用いて延長された。この手法は、クールチェーンと感染性ウイルスの取り扱いを維持する必要性を除去し、96ウェルハイスループットセットアップに適用することができます。
鳥インフルエンザウイルス(AIVs)は、ヒト1を含む多くの哺乳動物に、感染。これらAIVsは、ほとんどすべてのウイルスのサブタイプ2を抱いて、彼らの自然宿主では多種多様です。インフルエンザの人間のパンデミックとは、もともとAIVs 3から幹。近年のH5N1発生時に多くの致命的なヒト症例が報告された。最近、新しいAIV関連株は、"豚インフルエンザの流行'4を引き起こし、人間の人口を襲った。人間の売買および輸送活動は、高病原性の菌株5の広がりの原因であると思われますが、分散は、部分的に野鳥6,7に起因することができます。しかし、すべてのAIVの株の実際の貯水池は野鳥です。
このと養鶏産業の厳しい商業的損失の面での反応では、大規模なサーベイランスプログラムは、AIVsの生態に関する情報を収集するために、グローバルに実装されており、一定の高病原性の菌株8-12を検出するための早期警戒システムをインストールする。伝統的なウイルス学的方法は、ウイルスを調べて、分析する前に栽培される必要があります。これは、輸送時のように深い冷凍庫と重いバイオセーフティの手続きに厳格なコールドチェーンを必要とする。長期的なサーベイランスは、したがって、通常、設備の整った実験室の近くにいくつかのフィールドステーションに制限されています。ロジスティック面倒な手続きが実施されていない限り、遠隔地をサンプリングすることができます。これらの問題は、13を認識し、14および代替ストレージと交通戦略の使用は、(アルコールまたはグアニジン)15-17検討されている。最近、クラウスら 18は、特殊なろ紙に基づいて収集する方法、店舗と輸送AIVのサンプルを、導入しました。 FTAカード19は、乾式貯蔵の基準20にRNAを保持し、接点21に不活性な病原体をレンダリングします。本研究では、FTAカードが逆転写PCRでと得られたcDNAを配列決定し、ウイルスの遺伝子と決定できるようAIV RNAを検出するために使用することができることを示した。
クラウスらの研究。18に実験室AIVの分離を使用した、サンプルは個別に処理されていました。ここで紹介する拡張では、Ottenbyバード天文台(SEスウェーデン)で、アヒルのトラップから野生鳥類から糞便サンプルは野外条件下での手法の有用性を説明するために直接試験した。総排泄腔スワブでアヒルとサンプルの収集からキャッチすることが示されている。現在のプロトコルは、単一のチューブの処理から96ウェル設計への作業の流れのアップスケーリングが含まれています。従来の方法よりも感度が低いものの、FTAカードの方法は、大規模な監視スキームに優れたサプリメントを提供します。それは、アルコールやグアニジンのような危険な試薬、の出荷に関してクールなチェーンや安全規制を維持することなく、世界のどこからでもサンプルの収集と分析が可能になります。
ここで説明するプロトコルは、AIVの存在を糞便または類似のサンプルをスクリーニングするために補助的な方法を提供する。それは、特にサンプルの収集が迅速かつ容易に行えるように設計されました。これはAIの監視に貢献するため、そのような狩猟や野生生物の管理者として以下の訓練を受け、ことが可能となります。可能であればサンプルを凍結することは推奨されていますがないクールなチェーンは、適用する必要はありません。室温の数日間は、例えば実験室に輸送中に、カードが乾いたままである限り、FTAカード上のRNA分子のために問題はなかった。このようなアルコール15またはグアニジン16などの現在の研究コミュニティによって評価される他の非冷却ストレージシステム、、彼らの危険な性質のため、特別な輸送の手配が必要です。対照的に、FTAカードの方法は、有害物質の輸送を必要としません。しかし、この点では別の興味深い記憶媒体は、17のどちらか有害ではないことRNAlaterは™です。サンプルの分析は、標準的な分子生物学実験室で行うことができる。通常のPCR反応およびキャピラリーシークエンシングのため以外の特別な機器は必要ありませんでした。すでにサンプルのコレクションで潜在的な病原体はFTAカードの抗菌および抗ウイルス活性が不活性化されたので、すべてのステップは、バイオセイフティレベルなしで行うことができます。
交差汚染とその後の偽陽性検体は、野生の鳥のサンプルと私たちの試験で観察されなかった。しかし、RNAおよびPCRを扱う場合には、常に前後のPCRステップのために働く場所と別々の部屋をきれいにする特別な注意を払うことをお勧めします。ドラフト内で作業する研究室でエアロゾル汚染の危険性を減少させる。ピペッティングは、フィルタのヒントを実施する必要があります。
我々は84サンプルの6人は伝統的なリアルタイムRT – PCR法24で陽性とリアルタイムRT – PCRからのCt値がわかっていることを知っている同じカモから同時に採取された検体について過去の研究から。 Ct値<30(ウイルスRNAの高濃度を示す)持っていたアヒルから提案手法のステムによって検出された二つの正のサンプル。従来のプロトコルで陽性であった他の4つのサンプルはCt値> 30の(少ない集中)を有していたと我々のプロトコルによって検出することができませんでした。
相対的に高いウイルス力価を持つ唯一のサンプルは、私たちのアッセイで陽性であった、それは法の感度は、すべての陽性検体の検出に失敗の原因だった可能性があります。さらに、現在の研究のサンプルサイズは非常に低く、より制御し、厳密な実験が行われている場合、メソッドは、完全に開発し、評価することができます。これらのサンプルはリモート領域から収集されていた場合は、、伝統的な分析はまったく不可能だったでしょう。さらに、これらの最初の結果は、さらなる最適化を必要とするパイロット実験に由来する。サンプルの収集後に定期的に-20℃のフリーザーで二年間の保管期間は、おそらくまた、ウイルスRNAの品質に影響を与えた。この可能性RNAの分解は、不活化ウイルスの室温のストレージを扱う重要な問題です。上記のように別の液体に保存されているサンプルは、ウイルスゲノム16の長いストレッチの分析に影響を与える重要な劣化に苦しむ。私たちの研究でテストされていないものの、FTAカードは、鳥インフルエンザウイルス25、26と非常に類似している他のRNAのシステムでインタクトなRNA分子を保持するためによく適していることが証明されている。
The authors have nothing to disclose.
我々は技術支援のためにバートのDibbitsに感謝。動物の育種とゲノム解析グループ、ワーゲニンゲン大学、オランダは、惜しみなく実験室で私たちを開催しました。 Ottenby鳥天文台、スウェーデン、の職員は、特定のマグヌスヘルストリョーム、マーカスダニエルソン、クリストファーマグナソンとスティナアンダーソンで、マガモをトラップし、サンプリングのために感謝しています。我々は実験室での撮影のためにSanneスヴェンソン、ジョナタンQvistとOttenby TV撮影のための単位のアクセルGjöres、そして真野Camonに感謝。ダニエルBengtsonは、この出版物のビデオ部分のための美しいアヒルの写真を提供した。 CDCの公衆衛生のイメージライブラリからさらにフリー素材(PHIL、 http://phil.cdc.gov/phil/が )使用されていました:電子顕微鏡写真(番号280、博士アースキンパーマー)とイラストを(第11823;インフルエンザウイルスのダグラスヨルダン)で。財政支援はKNJV(オランダ王立ハンター協会)、農業のオランダ省、Faunafondsと開発元:StichtingデEik信託(オランダの両方)、スウェーデン研究評議会(助成金なし。2007から20774)とECによって与えられたNewflubirdプロジェクトを設立。 RNAの分離の化学物質は、Ambion、Incは、RNAの会社の寛大な贈り物でした。これはOttenbyバード天文台からの寄与第245です。
Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
FTA card | Whatman | several options | |
Harris micro punch 2mm with mat | Whatman | 1154409 | |
RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
One-Step Access RT-PCR system | Promega | A1250 | or comparable |
Agarose MP | Roche | 1388991001 | multi purpose agarose |
5x loading buffer | BioRad | delivered with DNA ladder | |
EZ load 100 bp ladder | BioRad | 170-8353 | or comparable |
Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | or comparable |
ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |