Une méthode pour préserver, de détecter et de séquence d'ARN à partir des virus grippaux aviaires a été validé et étendu en utilisant des échantillons de fèces naturelle des oiseaux. Cette technique élimine la nécessité de maintenir une chaîne du froid et la manipulation des virus infectieux et peuvent être appliquées dans un de 96 puits à haut débit de configuration.
Virus de l'influenza aviaire (AIVs) infectent de nombreux mammifères, y compris les humains 1. Ces AIVs sont divers dans leurs hôtes naturels, abritant presque tous les sous-types viraux possibles 2. Pandémies de grippe humaine à l'origine proviennent AIVs 3. Beaucoup de cas humains mortels au cours des flambées de H5N1 dans ces dernières années ont été signalés. Dernièrement, une souche nouvelle AIV liées balayé la population humaine, provoquant quatre «l'épidémie de grippe porcine». Bien que les échanges humains et de l'activité de transport semble être responsable de la propagation de souches hautement pathogènes 5, la dispersion peut également être attribuée en partie aux oiseaux sauvages 6, 7. Toutefois, le réservoir réel de toutes les souches AIV oiseaux sauvages.
En réaction à cela et face à de graves pertes commerciales dans l'industrie de la volaille, les programmes de surveillance ont été mises en œuvre de grandes globalement de recueillir des informations sur l'écologie des AIVs, et d'installer des systèmes d'alerte précoce pour détecter certaines souches hautement pathogènes 8-12. Les méthodes traditionnelles nécessitent virologiques des virus à être intact et cultivées avant l'analyse. Cela nécessite stricte des chaînes de froid avec des congélateurs et lourdes procédures de biosécurité à mettre en place pendant le transport. Surveillance à long terme est donc généralement limitée à une des stations de terrain proche de quelques laboratoires bien équipés. Les régions éloignées ne peuvent être prélevés si des procédures sont mises en œuvre logistique lourde. Ces problèmes ont été reconnus 13, 14 et l'utilisation du stockage et de stratégies alternatives de transport étudiés (alcools ou guanidine) 15-17. Récemment, Kraus et al. 18 a introduit une méthode pour collecter, stocker et transporter des échantillons AIV, basé sur un papier spécial filtre. ALE cartes 19 préserver l'ARN sur une base de stockage à sec 20 et rendre inactifs les agents pathogènes au contact 21. Cette étude a montré que les cartes FTA peut être utilisé pour détecter l'ARN dans AIV transcription inverse PCR et que l'ADNc résultant pourrait être séquencé les gènes du virus et déterminé.
Dans l'étude de Kraus et al. 18 un laboratoire d'isoler de l'AIV a été utilisé, et des échantillons ont été traités individuellement. Dans le prolongement présentées ici, des échantillons fécaux provenant d'oiseaux sauvages de la trappe de canard à l'Observatoire Ottenby Bird (SE Suède) ont été testés directement à illustrer l'utilité des méthodes sur le terrain. Attraper des canards et la collecte de l'échantillon par écouvillonnage cloacal est démontrée. Le protocole actuel comprend up-scaling du flux de travail d'une manipulation simple tube à une conception de 96 puits. Bien que moins sensible que les méthodes traditionnelles, la méthode de l'ALE cartes fournit un excellent complément aux régimes de surveillance important. Il permet la collecte et l'analyse des échantillons provenant de partout dans le monde, sans la nécessité de maintenir une chaîne du froid ou de règles de sécurité à l'égard de l'expédition des réactifs dangereux, comme l'alcool ou la guanidine.
Le protocole décrit ici fournit une méthode complémentaire à l'écran des échantillons fécaux ou similaires pour la présence de l'AIV. Il a été spécialement conçu pour rendre la collecte d'échantillon rapide et facile. Cela permet aux personnes de moins formés, comme les chasseurs ou les gestionnaires de la faune, de contribuer à la surveillance de l'IA. Pas de chaînes de froid doivent être appliquées, bien que la congélation des échantillons est recommandée lorsque cela est possible. A quelques jours de la température ambiante, par exemple lors du transport vers le laboratoire, ne sont pas un problème pour les molécules d'ARN sur les cartes FTA, aussi longtemps que les cartes sont restées sèches. D'autres systèmes de stockage non-refroidis qui sont actuellement évaluées par la communauté de la recherche, comme l'alcool 15 ou 16 guanidine, nécessitent des dispositions spéciales d'expédition en raison de leur caractère dangereux. En revanche, la méthode carte FTA ne nécessite pas de transport de matières dangereuses. Cependant, un autre support de stockage intéressante à cet égard est RNAlater ™ qui n'est pas dangereux, soit 17. L'analyse des échantillons peut être effectuée dans n'importe quel laboratoire moléculaire standard. Aucun équipement spécial autre que pour les réactions PCR et séquençage d'habitude capillaire a été nécessaire. Toutes les mesures qui pourraient être réalisées sans un niveau de biosécurité, car déjà à la collecte de l'échantillon des agents pathogènes potentiels ont été inactivés par l'activité antibactérienne et antivirale de la carte FTA.
Contamination croisée et ultérieures faux échantillons positifs n'ont pas été observés lors de nos essais avec des échantillons d'oiseaux sauvages. Toutefois, lorsque l'on travaille avec de l'ARN et PCR, il est toujours conseillé de porter une attention particulière à la propreté des lieux de travail et de salles séparées pour les étapes pré-et post-PCR. Travailler sous une hotte diminue le risque de contamination par aérosol dans le laboratoire. Pipetage doit être effectuée avec des conseils de filtre.
Partir d'une étude précédente sur des échantillons prélevés simultanément à partir des canards mêmes, nous savons que six des 84 échantillons étaient positifs par le RealTime traditionnelle méthode RT-PCR 24 et les valeurs Ct de Realtime RT-PCR sont connues. Les deux échantillons positifs détectés par notre méthode de la tige de canards qui avaient des valeurs de Ct <30 (indiquant une forte concentration de l'ARN viral). Les quatre autres échantillons qui étaient positifs avec le protocole traditionnel avait valeurs Ct> 30 (moins concentré) et ne pouvaient pas être détectés par notre protocole.
Seuls les échantillons avec des titres de virus relativement élevé ont été positifs dans notre test et il est probable que la sensibilité de la méthode a été la source de l'échec de détecter tous les échantillons positifs. En outre, la taille de l'échantillon de l'étude actuelle a été très faible et la méthode peut être entièrement développé et évalué si des expériences plus contrôlé et rigoureux sont effectués. Cependant, si ces échantillons ont été collectés dans une zone distante, l'analyse traditionnelle n'aurait pas été possible du tout. De plus, ces premiers résultats proviennent des expériences pilotes qui ont besoin d'une optimisation plus poussée. Une période de deux années de stockage dans un congélateur régulièrement -20 ° C après prélèvement probablement aussi affecté la qualité de l'ARN viral. Cette dégradation possible de l'ARN est une question importante lorsqu'il s'agit de stockage à température ambiante de virus inactivés. Les échantillons stockés dans les liquides alternatifs comme mentionné plus haut souffrent d'une dégradation importante qui a des répercussions analyse des séquences plus longues de l'génome viral 16. Bien que n'étant pas testées dans notre étude, les cartes FTA se sont avérés bien adaptés pour préserver intactes les molécules d'ARN dans les systèmes de l'ARN d'autres qui sont très similaires aux virus de la grippe aviaire 25, 26.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Dibbits Bert pour l'assistance technique. L'élevage et du Groupe de génomique, Université de Wageningen, Pays-Bas, nous a généreusement hébergé dans leur laboratoire. Le personnel de l'Observatoire Ottenby Bird, la Suède, est remercié pour le piégeage et l'échantillonnage des colverts, en particulier Hellström Magnus, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson et Stina Andersson. Nous remercions Sanne Svensson, Jonatan Qvist et Per-Axel Gjöres pour filmer au Ottenby, et Mano Camon pour le tournage dans le laboratoire. Daniel Bengtson fourni des photographies de canard magnifique pour la partie vidéo de cette publication. En outre matériau exempt de la Bibliothèque CDC Public Image Santé (PHIL; http://phil.cdc.gov/phil/ ) a été utilisée: La microscopie électronique (n ° 280; par le Dr. Erskine Palmer) et de l'illustration (n ° 11823; par Douglas Jordanie) du virus de la grippe. Un soutien financier a été donné par le KNJV (Royal Netherlands Association des chasseurs), le ministère néerlandais de l'Agriculture, de l'Faunafonds et la Stichting de fiducies Eik (à la fois aux Pays-Bas), le Conseil de recherche suédois (subvention aucune. 2007-20774) et la CE fondée Newflubird projet. Produits chimiques d'isolement d'ARN ont été un généreux don de Ambion, Inc, la compagnie ARN. Ceci est la contribution n ° 245 de l'Observatoire Ottenby oiseaux.
Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
FTA card | Whatman | several options | |
Harris micro punch 2mm with mat | Whatman | 1154409 | |
RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
One-Step Access RT-PCR system | Promega | A1250 | or comparable |
Agarose MP | Roche | 1388991001 | multi purpose agarose |
5x loading buffer | BioRad | delivered with DNA ladder | |
EZ load 100 bp ladder | BioRad | 170-8353 | or comparable |
Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | or comparable |
ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |