שיטה לשמר, לזהות רצף הרנ"א מפני וירוסים שפעת העופות היה תוקף המורחבת באמצעות דגימות צואה טבעיים ציפורים. טכניקה זו מסירה את הצורך של שמירה על שרשרת מגניב וטיפול וירוסים זיהומיות ניתן ליישם תוכנית ההתקנה של תפוקה גבוהה 96-היטב.
נגיפי שפעת העופות (AIVs) להדביק יונקים רבים, כולל בני אדם 1. AIVs אלה הם מגוונים המארחים הטבעי שלהם, מחסה כמעט את כל תת ויראלי אפשרי 2. מגיפות שפעת במקור של האדם נובעות AIVs 3. במקרים רבים אדם קטלנית במהלך התפרצויות H5N1 בשנים האחרונות דווחו. באחרונה זן חדש AIV הקשורות ששטפו את האוכלוסייה האנושית, גרימת 4 של מגיפת שפעת החזירים ". למרות סחר אנושי פעילות התחבורה שנראה אחראי להתפשטות של זנים פתוגניים מאוד 5, הפיזור יכול גם לייחס בחלקו ציפורי בר 6, 7. עם זאת, המאגר בפועל של כל זני AIV הוא ציפורי בר.
בתגובה זו מול הפסדים מסחרי חמורה בענף העופות, תוכניות מעקב גדול יושמו ברחבי העולם כדי לאסוף מידע על האקולוגיה של AIVs, ולהתקין מערכות התרעה לגילוי זנים פתוגניים מסוימים מאוד 8-12. שיטות מסורתיות דורשות virological וירוסים להיות שלמים מעובדים לפני ניתוח. זה מחייב רשתות קר מחמירים עם מקפיאים עמוק וכבד נהלים biosafety להיות במקום במהלך ההובלה. מעקב לטווח ארוך ולכן הוא מוגבל בדרך כלל תחנות בשדה כמה קרוב במעבדות מצוידות היטב. באזורים מרוחקים ולא ניתן שנדגמו אלא הליכים מסורבלים מבחינה לוגיסטית מיושמים. בעיות אלה הוכרו 13, 14 והשימוש אחסון חלופי ואסטרטגיות תחבורה נחקר (כהלים או guanidine) 15-17. לאחרונה, הציג קראוס ואח'. 18 שיטה לאסוף, לאגור ולהעביר דגימות AIV, המבוסס על נייר מסנן מיוחד. FTA כרטיסים 19 לשמר RNA על בסיס אחסון יבש 20 ו לדקלם פתוגנים פעיל במגע 21. מחקר זה הראה כי כרטיסי FTA יכול לשמש כדי לזהות AIV רנ"א הפוכה שעתוק PCR וכי cDNA וכתוצאה מכך יכול להיות רצף גנים וירוס ונחוש.
במחקר של קראוס ואח'. 18 מעבדה לבודד של AIV היה בשימוש, דגימות טופלו בנפרד. בשנת ההארכה שהוצגו כאן, דגימות צואה מן ציפורי בר ממלכודת ברווז על ציפור Ottenby במצפה (SE שוודיה) נבדקו ישירות כדי להמחיש את התועלת של שיטות בתנאי שדה. לתפוס ברווזים אוסף מדגם ידי דגימות ביוב מודגם. פרוטוקול הנוכחית כוללת למעלה דרוג של זרימת עבודה מתוך טיפול צינור אחד לעצב 96-היטב. למרות רגיש פחות מאשר שיטות מסורתיות, שיטת FTA כרטיסי מספק תוספת מצוינת תוכניות מעקב גדולים. היא מאפשרת איסוף וניתוח של דגימות מכל מקום בעולם, ללא צורך בשמירה על שרשרת מגניב או תקנות הבטיחות לגבי משלוח של חומרים כימיים מסוכנים, כגון אלכוהול או guanidine.
פרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה משלים מסך דגימות צואה או דומה לנוכחות של AIV. הוא תוכנן במיוחד כדי להפוך אוסף מדגם מהירה וקלה. זה מאפשר לאנשים מיומנים פחות, כמו ציידים או מנהלי טבע, לתרום מעקב AI. אין רשתות מגניב צריך להיות מיושם, למרות הקפאת דגימות מומלץ במידת האפשר. כמה ימים של בטמפרטורת החדר, למשל במהלך ההובלה למעבדה, לא היו בעיה של מולקולות RNA על כרטיסי FTA, כל עוד כרטיסים נותרו יבשות. אחרים ללא כוונת מקורר מערכות אחסון מוערכים כיום על ידי קהילת המחקר, כגון אלכוהול 15 או 16 guanidine, דורשים הסדרים משלוח מיוחד בשל אופיו מסוכנים שלהם. לעומת זאת, השיטה כרטיס FTA אינו מחייב משלוח של חומרים מסוכנים. עם זאת, אחר בינוני אחסון מעניין בהקשר זה הוא RNAlater ™ זה לא מסוכן, או 17. ניתוח לדוגמה יכול להתבצע במעבדה כל מולקולרי רגיל. אין ציוד מיוחד אחר מאשר כרגיל PCR תגובות וסדר נימי היה צורך. כל השלבים יכול להתבצע ללא רמה biosafety כי כבר אוסף המדגם סוכני פתוגניים פוטנציאל היו מומת על ידי פעילות נגד חיידקים נגיפים של כרטיס FTA.
חוצה זיהום ובעקבות דגימות חיוביות כוזבות לא נצפו בניסויים שלנו עם דגימות צפור פראית. עם זאת, כאשר עובדים עם RNA ו-PCR זה תמיד רצוי להקדיש תשומת לב מיוחדת לנקות מקומות עבודה בחדרים נפרדים עבור שלבים לפני ואחרי-PCR. עבודה במנדף עשן מקטין את הסיכון של זיהום אירוסול במעבדה. Pipetting צריך להתבצע עם טיפים הסינון.
ממחקר קודם על דגימות שנלקחו בעת ובעונה אחת מן ברווזים אותו אנו יודעים כי שישה מתוך 84 דגימות היו חיוביות ידי RealTime המסורתי RT-PCR שיטה 24 והערכים Ct מ RealTime RT-PCR ידועים. שתי דגימות חיוביות זוהה על ידי גזע השיטה שלנו ברווזים שהיו ערכים Ct <30 (המעיד על ריכוז גבוה של רנ"א נגיפי). ארבע הדוגמאות האחרות אשר היו חיוביות עם פרוטוקול המסורתי היו לערכים Ct> 30 (מרוכז פחות) לא יכול להיות מזוהים על ידי פרוטוקול שלנו.
דגימות נגיף רק עם titers גבוהה יחסית היו חיוביות assay שלנו, סביר להניח כי הרגישות של השיטה היה מקור הכישלון כדי לזהות את כל דגימות חיוביות. יתר על כן, גודל המדגם במחקר הנוכחי היה נמוך מאוד ואת השיטה ניתן לפתח לחלוטין להעריך אם ניסויים מבוקרים יותר קפדני מתבצעות. עם זאת, אם אלה היו דוגמאות שנאספו באזור מרוחק, ניתוח מסורתי לא היה אפשרי בכלל. בנוסף, אלה התוצאות הראשונות נובעות ניסויי פיילוט אשר צריך אופטימיזציה נוספת. תקופה של שנתיים אחסון בתוך מקפיא רגיל -20 ° C לאחר איסוף דגימת כנראה השפיע גם על האיכות של רנ"א נגיפי. זו השפלה אפשרי RNA הוא נושא חשוב בהתמודדות עם אחסון בטמפרטורת חדר של וירוסים מומת. דוגמאות מאוחסנים נוזלים חלופה כאמור סובלים השפלה משמעותי אשר משפיע על ניתוח מותח יותר של הגנום הויראלי 16. אמנם לא נבדק במחקר שלנו, כרטיסי FTA הוכיחו להיות מתאים גם כדי לשמור על שלמות מולקולות RNA אחרות מערכות רנ"א דומים מאוד נגיפי שפעת העופות 25, 26.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים Dibbits ברט לקבלת סיוע טכני. גידול בעלי חיים קבוצה Genomics, אוניברסיטת Wageningen, הולנד, אירח אותנו בנדיבות במעבדה שלהם. צוות של ציפור Ottenby המצפה, שבדיה, הוא הודה על השמנה הדגימה ברכיות, בפרט Hellström מגנוס, מרקוס דניאלסון, כריסטופר מגנוסון ו סטינה אנדרסון. אנו מודים וסאנה Svensson, יונתן Qvist ו Per-אקסל Gjöres לצילום בבית Ottenby ו מנו Camon לצילום במעבדה. דניאל Bengtson סיפק תמונות ברווז יפה עבור חלק הווידאו של פרסום זה. חומר נוסף חינם מן הספרייה הציבורית של ה-CDC הבריאות תמונה (פיל; http://phil.cdc.gov/phil/ ) שימש: מיקרוסקופ אלקטרונים (מס '280, על ידי ד"ר ארסקין פאלמר) ואיור (מס' 11823; על ידי דאגלס ירדן) של נגיף השפעת. תמיכה כספית ניתנה על ידי KNJV (רויאל הולנד ציידים האגודה), משרד הולנדית החקלאות, Faunafonds ואת דה Stichting Eik נאמנויות (הן הולנד), השוודית המועצה למחקר (לא מענק. 2007-20774) ואת EC מבוסס Newflubird הפרויקט. כימיקלים RNA הבידוד היו מתנה נדיבה של Ambion, Inc, חברת RNA. זוהי תרומה מס '245 של בירד Ottenby המצפה.
Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
FTA card | Whatman | several options | |
Harris micro punch 2mm with mat | Whatman | 1154409 | |
RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
One-Step Access RT-PCR system | Promega | A1250 | or comparable |
Agarose MP | Roche | 1388991001 | multi purpose agarose |
5x loading buffer | BioRad | delivered with DNA ladder | |
EZ load 100 bp ladder | BioRad | 170-8353 | or comparable |
Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | or comparable |
ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |