Detección rápida de patógenos bacterianos que causan infecciones del tracto respiratorio inferior a través de la amplificación isotérmica mediada por bucle basada en chips microfluídicos
Summary
Varios patógenos bacterianos pueden causar infecciones del tracto respiratorio y provocar graves problemas de salud si no se detectan con precisión y se tratan con prontitud. La detección rápida y precisa de estos patógenos a través de la amplificación isotérmica mediada por bucle proporciona una gestión y un control eficaces de las infecciones del tracto respiratorio en entornos clínicos.
Abstract
Las infecciones del tracto respiratorio (ITR) se encuentran entre los problemas más comunes en los entornos clínicos. La identificación rápida y precisa de los patógenos bacterianos proporcionará directrices prácticas para el manejo y tratamiento de las infecciones respiratorias crónicas. Este estudio describe un método para detectar rápidamente patógenos bacterianos que causan infecciones del tracto respiratorio a través de la amplificación isotérmica mediada por bucle multicanal (LAMP). LAMP es una herramienta diagnóstica sensible y específica que detecta rápidamente los ácidos nucleicos bacterianos con alta precisión y fiabilidad. El método propuesto ofrece una ventaja significativa sobre los métodos tradicionales de cultivo bacteriano, que requieren mucho tiempo y a menudo requieren una mayor sensibilidad para detectar niveles bajos de ácidos nucleicos bacterianos. En este artículo se presentan resultados representativos de la infección por K. pneumoniae y sus múltiples coinfecciones utilizando LAMP para la detección de muestras (esputo, líquido de lavado bronquial y líquido de lavado alveolar) del tracto respiratorio inferior. En resumen, el método LAMP multicanal proporciona un medio rápido y eficiente para identificar patógenos bacterianos únicos y múltiples en muestras clínicas, lo que puede ayudar a prevenir la propagación de patógenos bacterianos y ayudar en el tratamiento adecuado de las ITR.
Introduction
Las infecciones del tracto respiratorio (ITR) causadas por patógenos bacterianos contribuyen principalmente a la morbilidad y mortalidad en todo el mundo1. Se define como cualquier síntoma de las vías respiratorias superiores o inferiores acompañado de fiebre que dura 2-3 días. Si bien la infección de las vías respiratorias superiores es más común que la infección de las vías respiratorias inferiores, las infecciones crónicas y recurrentes de las vías respiratorias también son afecciones clínicas comunes, que plantean grandes riesgos para las personas y suponen una carga significativa para los sistemas de salud2. Los patógenos bacterianos comunes de las RTI incluyen Streptococcus pneumoniae3, Haemophilus influenzae4, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia, entre otros. Estas bacterias patógenas suelen colonizar las superficies mucosas de la nasofaringe y el tracto respiratorio superior del huésped, causando síntomas típicos de las infecciones respiratorias agudas, como dolor de garganta y bronquitis. Causan neumonía cuando se propagan desde el tracto respiratorio superior a áreas estériles del tracto respiratorio inferior y pueden propagarse de persona a persona a través del tracto respiratorio5. En casos graves, también pueden provocar enfermedades bacterianas invasivas, especialmente neumonía bacteriémica, meningitis y sepsis, que son las principales causas de morbilidad y mortalidad en personas de todos los grupos de edad en todo el mundo.
Las pruebas tradicionales para las ITR implican el cultivo microbiológico utilizando hisopos faríngeos y muestras respiratorias de esputo6. Además, las pruebas serológicas, como el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA), detectan anticuerpos o antígenos en el suero, mientras que las pruebas de aglutinación observan la reacción de aglutinación de anticuerpos y antígenos para detectar la infección7. El cultivo microbiano se considera el estándar de oro para el diagnóstico de las ITR, pero su baja tasa de positividad del cultivo, su escasa fiabilidad y su largo ciclo de detección limitan la eficacia diagnóstica8. En realidad, el diagnóstico rápido y preciso de las infecciones respiratorias agudas es crucial para la erradicación precisa del patógeno bacteriano. Los métodos de detección rápidos y eficaces pueden ayudar a reducir la tasa de transmisión de patógenos, acortar la duración de la infección y disminuir el uso innecesario de antibióticos 9,10. Los métodos basados en la biología molecular aceleran significativamente la detección, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que amplifica la secuencia de ADN de un gen objetivo para detectar patógenos. Sin embargo, la PCR tradicional requiere un equipo complejo de ciclo de temperatura, que es engorroso y requiere mucho tiempo. Además, cada amplificación de ADN mediante PCR (excepto la PCR en tiempo real) concluye con la separación electroforética del producto, lo que también lleva tiempo. La visualización del producto requiere tintes, muchos de los cuales son mutagénicos o cancerígenos. Por lo tanto, es imperativo desarrollar continuamente nuevos métodos y tecnologías para diagnosticar patógenos bacterianos RTI.
La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es una tecnología molecular novedosa y emergente desarrollada inicialmente por Notomi et al. en 200011. LAMP puede amplificar el ADN en condiciones isotérmicas estables sin equipos complejos de ciclo de temperatura, lo que lo hace adecuado para la detección rápida y reduce la complejidad y el costo del equipo12. LAMP puede detectar bajas concentraciones de ADN objetivo con alta sensibilidad13. Utiliza múltiples cebadores específicos para mejorar la selectividad de las secuencias diana y reducir la posibilidad de falsos positivos14. Poco a poco, LAMP se está utilizando ampliamente en los laboratorios clínicos debido a su facilidad, rapidez e intuitivo funcionamiento, incluso para detectar RTI. En este estudio, investigamos la efectividad de LAMP en la detección de RTI más bajos en muestras clínicas (esputo, líquido de lavado bronquial y líquido de lavado alveolar), como se muestra en la Figura 1. Es evidente que LAMP ofrece ventajas como la velocidad, la sensibilidad y la facilidad de uso sobre las pruebas tradicionales en la detección de RTI más bajos, lo que lo convierte en una aplicación prometedora.
Figura 1: Ilustración esquemática del método de detección LAMP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las infecciones del tracto respiratorio son infecciones prevalentes asociadas al hospital, que imponen graves consecuencias a los pacientes y aumentan las tasas de mortalidad16. La identificación oportuna y precisa de los patógenos potenciales, seguida de antibióticos eficaces, es la clave para el éxito del tratamiento y la mejora del pronóstico, especialmente dadas las limitaciones inherentes a los métodos de cultivo tradicionales17. En este estudio, utilizamos un m?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apreciamos enormemente el apoyo financiero brindado por la Fundación de Investigación Básica y Básica Aplicada de Guangdong (Subvención No. 2022A1515220023) y la Fundación de Investigación para Talentos Avanzados del Hospital Popular Provincial de Guandong (Subvención No. KY012023293).
Materials
| Bath Incubator(MK2000-2) | ALLSHENG | Provide a constant temperature environment | |
| Bronchial lavage fluid collector head | TIANPINGHUACHANG | SEDA 20172081375 | Collecting bronchoalveolar lavage fluid |
| Fiberoptic bronchoscope | OLYMPUS | SEDA 20153062703 | A flexible bronchoscope equipped with a fiberoptic light source and camera, to visually examine the airways and structures within the lungs. Assist in collecting bronchoalveolar lavage |
HR1500- B2 |
Haier | SEDA 20183541642 | Biosafety cabinet |
| NAOH | MACKLIN | S817977 | Liquefy viscous lower respiratory tract sample |
| Nucleic acid detection kit for respiratory tract pathogens | Capitalbio Technology | SEDA 20173401346 | Testing for bacteria infection |
| Nucleic acid extraction reagent | Capitalbio Technology | SEDA 20160034 | For DNA extraction |
| RTisochip-W | Capitalbio Technology | SEDA 20193220539 | Loop-mediated Isothermal Amplification |
| THERMO ST16R | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20180585 | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. |
| Vortex mixer VM-5005 | JOANLAB | For mixing reagent |
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