Microfluidic-Chip-based Loop-Mediated Isothermal Amplification을 통해 하기도 감염을 일으키는 세균성 병원체의 신속한 검출
Summary
다양한 박테리아 병원체는 호흡기 감염을 일으킬 수 있으며 정확하게 감지하고 신속하게 치료하지 않으면 심각한 건강 문제를 초래할 수 있습니다. 루프 매개 등온 증폭을 통해 이러한 병원체를 빠르고 정확하게 검출하면 임상 환경에서 호흡기 감염을 효과적으로 관리하고 제어할 수 있습니다.
Abstract
호흡기 감염(RTI)은 임상 환경에서 가장 흔한 문제 중 하나입니다. 세균성 병원체의 신속하고 정확한 식별은 RTI의 관리 및 치료를 위한 실용적인 지침을 제공할 것입니다. 이 연구는 다중 채널 루프 매개 등온 증폭(LAMP)을 통해 호흡기 감염을 일으키는 세균성 병원체를 신속하게 검출하는 방법을 설명합니다. LAMP는 높은 정확도와 신뢰성으로 박테리아 핵산을 신속하게 검출하는 민감하고 특이적인 진단 도구입니다. 제안된 방법은 시간이 많이 걸리고 종종 낮은 수준의 박테리아 핵산을 검출하기 위해 더 높은 감도를 필요로 하는 기존 박테리아 배양 방법에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 이 논문은 K. pneumoniae 감염 및 LAMP를 사용하여 하부 호흡기에서 검체(객담, 기관지 세척액 및 폐포 세척액)를 검출하는 다중 동시 감염의 대표적인 결과를 제시합니다. 요약하면, 다중 채널 LAMP 분석법은 임상 샘플에서 단일 및 다중 세균 병원체를 식별하는 빠르고 효율적인 수단을 제공하며, 이는 세균 병원체의 확산을 방지하고 RTI의 적절한 치료를 지원하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
세균성 병원체에 의한 호흡기 감염(RTI)은 주로 전 세계적으로 이환율과 사망률에 기여합니다1. 2-3일 동안 지속되는 발열을 동반하는 상부 또는 하부 호흡기 증상으로 정의됩니다. 상기도 감염이 하기도 감염보다 더 흔하지만, 만성 및 재발성 호흡기 감염도 흔한 임상 상태로서 개인에게 큰 위험을 초래하고 의료 시스템에 상당한 부담을 준다2. RTI의 일반적인 세균성 병원체로는 폐렴구균3, 헤모필루스 인플루엔자4, 황색포도상구균, 대장균, 폐렴균, 스테노트로포모나스 말토필리아 등이 있습니다. 이러한 병원성 박테리아는 일반적으로 숙주의 비인두와 상부 호흡기의 점막 표면에 서식하여 인후통 및 기관지염과 같은 RTI의 전형적인 증상을 유발합니다. 폐렴은 상부 호흡기에서 하부 호흡기의 무균 영역으로 퍼질 때 폐렴을 일으키며, 호흡기를 통해 사람에서 사람으로 퍼질 수 있다5. 심한 경우에는 침습성 세균성 질환, 특히 세균성 폐렴, 뇌수막염 및 패혈증으로 이어질 수 있으며, 이는 전 세계 모든 연령대의 사람들에서 이환율과 사망률의 주요 원인입니다.
RTI에 대한 전통적인 검사는 인후 면봉과 객담 호흡기 샘플을 사용한 미생물 배양이 포함된다6. 또한 효소 결합 면역 흡착 검사(ELISA)와 같은 혈청학적 검사는 혈청에서 항체 또는 항원을 검출하는 반면, 응집 검사는 항체와 항원의 응집 반응을 관찰하여 감염을 감지합니다7. 미생물 배양은 RTI 진단을 위한 황금 표준으로 간주되지만 배양 양성률이 낮고 신뢰성이 낮으며 검출 주기가 길어 진단 효율성이 제한됩니다8. 실제로 RTI의 신속하고 정확한 진단은 박테리아 병원체의 정확한 박멸에 매우 중요합니다. 빠르고 효과적인 검출 방법은 병원체의 전염 속도를 줄이고 감염 기간을 단축하며 불필요한 항생제 사용을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다 9,10. 분자 생물학 기반 방법은 표적 유전자의 DNA 염기서열을 증폭하여 병원체를 검출하는 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 검출 속도를 크게 높입니다. 그러나 기존 PCR은 번거롭고 시간이 많이 소요되는 복잡한 온도 순환 장비를 필요로 합니다. 또한 PCR을 사용한 모든 DNA 증폭(실시간 PCR 제외)은 시간이 걸리는 산물의 전기영동 분리로 마무리됩니다. 제품을 시각화하려면 염료가 필요하며, 그 중 다수는 돌연변이 유발성 또는 발암성입니다. 따라서 RTI 세균성 병원체를 진단하기 위한 새로운 방법과 기술을 지속적으로 개발해야 합니다.
LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)는 2000년 Notomi et al.이 처음 개발한 새롭고 새로운 분자 기술입니다11. LAMP는 복잡한 온도 사이클링 장비 없이 안정적인 등온 조건에서 DNA를 증폭할 수 있어 신속한 검출에 적합하고 장비 복잡성과 비용을 줄입니다12. LAMP는 고감도로 낮은 농도의 표적 DNA를 검출할 수 있다13. 여러 특정 프라이머를 사용하여 표적 염기서열에 대한 선택성을 개선하고 위양성(false positive)의 가능성을 줄입니다14. LAMP는 RTI 검출에도 용이성, 속도 및 직관적인 작동으로 인해 임상 실험실에서 점차 널리 사용되고 있습니다. 이 연구에서는 그림 1과 같이 임상 샘플(객담, 기관지 세척액 및 폐포 세척액)에서 더 낮은 RTI를 감지하는 LAMP의 효과를 조사했습니다. LAMP는 낮은 RTI 감지에서 기존 테스트에 비해 속도, 감도 및 사용 편의성과 같은 이점을 제공하여 유망한 응용 분야임이 분명합니다.
그림 1: LAMP 감지 방법의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
호흡기 감염은 병원 관련 감염이 만연하여 환자에게 심각한 결과를 초래하고 사망률을 높인다16. 잠재적인 병원체를 시기적절하고 정확하게 식별한 후 효과적인 항생제를 투여하는 것이 성공적인 치료와 예후 개선의 핵심이며, 특히 전통 배양 방법에 내재된 한계를 감안할 때더욱 그렇다 17. 이 연구에서는 RTI를 빠르고 정확하게 탐지하기 위해 LAMP 기반 방법을 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 광둥성 기초 및 응용 기초 연구 재단(보조금 번호 2022A1515220023)과 광동성 인민병원 고급 인재 연구 재단(보조금 번호)이 제공하는 재정적 지원에 크게 감사드립니다. KY012023293).
Materials
| Bath Incubator(MK2000-2) | ALLSHENG | Provide a constant temperature environment | |
| Bronchial lavage fluid collector head | TIANPINGHUACHANG | SEDA 20172081375 | Collecting bronchoalveolar lavage fluid |
| Fiberoptic bronchoscope | OLYMPUS | SEDA 20153062703 | A flexible bronchoscope equipped with a fiberoptic light source and camera, to visually examine the airways and structures within the lungs. Assist in collecting bronchoalveolar lavage |
HR1500- B2 |
Haier | SEDA 20183541642 | Biosafety cabinet |
| NAOH | MACKLIN | S817977 | Liquefy viscous lower respiratory tract sample |
| Nucleic acid detection kit for respiratory tract pathogens | Capitalbio Technology | SEDA 20173401346 | Testing for bacteria infection |
| Nucleic acid extraction reagent | Capitalbio Technology | SEDA 20160034 | For DNA extraction |
| RTisochip-W | Capitalbio Technology | SEDA 20193220539 | Loop-mediated Isothermal Amplification |
| THERMO ST16R | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20180585 | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. |
| Vortex mixer VM-5005 | JOANLAB | For mixing reagent |
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