マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出
Summary
さまざまな細菌性病原体は、正確に検出され、迅速に治療されない場合、気道感染症を引き起こし、深刻な健康問題を引き起こす可能性があります。ループを介した等温増幅 によるこれらの病原体の迅速かつ正確な検出は、臨床現場での気道感染症の効果的な管理と制御を提供します。
Abstract
気道感染症(RTI)は、臨床現場で最も一般的な問題の1つです。細菌性病原体の迅速かつ正確な同定は、RTIの管理と治療のための実用的なガイドラインを提供します。この研究では、多チャンネルループ媒介等温増幅(LAMP)を介して気道感染症を引き起こす細菌性病原体を迅速に検出する方法について説明しています。LAMPは、細菌の核酸を高い精度と信頼性で迅速に検出する、高感度で特異的な診断ツールです。提案された方法は、時間がかかり、低レベルの細菌核酸を検出するためにより高い感度を必要とすることが多い従来の細菌培養方法に比べて大きな利点を提供します。この記事では、LAMPを使用して下気道からのサンプル(喀痰、気管支洗浄液、および肺胞洗浄液)を検出した肺 炎菌 感染とその複数の同時感染の代表的な結果を示します。要約すると、マルチチャンネルLAMP法は、臨床サンプル中の単一および複数の細菌性病原体を迅速かつ効率的に同定する手段を提供し、細菌性病原体の拡散を防ぎ、RTIの適切な治療を支援することができます。
Introduction
細菌性病原体によって引き起こされる気道感染症(RTI)は、主に世界中で罹患率と死亡率の一因となっています1。これは、2〜3日間続く発熱を伴う上気道または下気道の症状として定義されます。上気道感染症は下気道感染症よりも一般的ですが、慢性および再発性気道感染症も一般的な臨床疾患であり、個人に大きなリスクをもたらし、医療システムに大きな負担をかけています2。RTIの一般的な細菌性病原体には、 Streptococcus pneumoniae3、 Haemophilus influenzae4、 黄色ブドウ球菌、 大腸菌、 Klebsiella pneumoniae、 Stenotrophomonas maltophiliaなどがあります。これらの病原菌は通常、宿主の鼻咽頭と上気道の粘膜表面にコロニーを形成し、喉の痛みや気管支炎などのRTIの典型的な症状を引き起こします。上気道から下気道の無菌領域に広がると肺炎を引き起こし、気道を通じて人から人へ広がる可能性があります5。重症の場合、侵襲性細菌性疾患、特に細菌性肺炎、髄膜炎、敗血症を引き起こす可能性もあり、これらは世界中のすべての年齢層の人々の罹患率と死亡率の主な原因です。
RTIの従来の検査には、咽頭スワブと喀痰呼吸器サンプルを使用した微生物学的培養が含まれます6。さらに、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などの血清学的検査では、血清中の抗体や抗原を検出し、凝集検査では抗体や抗原の凝集反応を観察して感染を検出します7。微生物培養はRTIの診断のゴールドスタンダードと考えられていますが、培養陽性率が低く、信頼性が低く、検出サイクルが長いため、診断効率が制限されています8。実際には、RTIの迅速かつ正確な診断は、細菌性病原体の正確な根絶に不可欠です。迅速かつ効果的な検出方法は、病原体の感染率を減らし、感染期間を短縮し、不要な抗生物質の使用を減らすのに役立ちます9,10。分子生物学に基づく方法は、標的遺伝子のDNA配列を増幅して病原体を検出するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)など、検出を大幅に迅速化します。しかし、従来のPCRでは、複雑な温度サイクル装置が必要であり、面倒で時間がかかります。さらに、PCR(リアルタイムPCRを除く)を使用したすべてのDNA増幅は、製品の電気泳動分離で終了しますが、これにも時間がかかります。製品の視覚化には染料が必要ですが、その多くは変異原性または発がん性があります。したがって、RTI細菌性病原体を診断するための新しい方法と技術を継続的に開発することが不可欠です。
Loop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP)は、2000年にNotomiらによって最初に開発された新しい分子技術です11。LAMPは、複雑な温度サイクル装置を使用せずに安定した等温条件下でDNAを増幅できるため、迅速な検出に適しており、装置の複雑さとコストが削減されます12。LAMPは、低濃度の標的DNAを高感度で検出できる13。複数の特異的プライマーを使用して、標的配列の選択性を向上させ、偽陽性の可能性を減らします14。LAMPは、RTIの検出にも、その容易さ、速度、直感的な操作により、臨床検査室で徐々に広く使用されています。本研究では、 図1に示すように、臨床検体(喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液)中の低RTI検出におけるLAMPの有効性を調査しました。LAMPは、低RTI検出で従来のテストよりも速度、感度、使いやすさなどの利点を提供し、有望なアプリケーションであることは明らかです。
図1:LAMP検出方式の概略図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
気道感染症は、院内感染症として蔓延しており、患者に深刻な影響を及ぼし、死亡率を上昇させています16。潜在的な病原体をタイムリーかつ正確に特定し、その後に効果的な抗生物質を使用することは、特に伝統的な培養方法に固有の制限を考えると、治療を成功させ、予後を改善するための鍵です17。この研究では、LAMPベースの方法を使用して、RTIの?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
広東省基礎応用基礎研究基金会(Grant No. 2022A1515220023)とGuandong Provincial People’s Hospitalの先端才能研究基金会(Grant No.KY012023293)。
Materials
| Bath Incubator(MK2000-2) | ALLSHENG | Provide a constant temperature environment | |
| Bronchial lavage fluid collector head | TIANPINGHUACHANG | SEDA 20172081375 | Collecting bronchoalveolar lavage fluid |
| Fiberoptic bronchoscope | OLYMPUS | SEDA 20153062703 | A flexible bronchoscope equipped with a fiberoptic light source and camera, to visually examine the airways and structures within the lungs. Assist in collecting bronchoalveolar lavage |
HR1500- B2 |
Haier | SEDA 20183541642 | Biosafety cabinet |
| NAOH | MACKLIN | S817977 | Liquefy viscous lower respiratory tract sample |
| Nucleic acid detection kit for respiratory tract pathogens | Capitalbio Technology | SEDA 20173401346 | Testing for bacteria infection |
| Nucleic acid extraction reagent | Capitalbio Technology | SEDA 20160034 | For DNA extraction |
| RTisochip-W | Capitalbio Technology | SEDA 20193220539 | Loop-mediated Isothermal Amplification |
| THERMO ST16R | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20180585 | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. |
| Vortex mixer VM-5005 | JOANLAB | For mixing reagent |
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