Быстрое обнаружение бактериальных патогенов, вызывающих инфекции нижних дыхательных путей, с помощью изотермической амплификации, опосредованной петлей на основе микрофлюидных чипов
Summary
Различные бактериальные патогены могут вызывать инфекции дыхательных путей и приводить к серьезным проблемам со здоровьем, если их не выявить точно и не лечить своевременно. Быстрое и точное обнаружение этих патогенов с помощью петлевой изотермической амплификации обеспечивает эффективное лечение и контроль инфекций дыхательных путей в клинических условиях.
Abstract
Инфекции дыхательных путей (ИРТ) являются одними из наиболее распространенных проблем в клинических условиях. Быстрая и точная идентификация бактериальных патогенов обеспечит практические рекомендации по ведению и лечению ИРТ. В этом исследовании описывается метод быстрого обнаружения бактериальных патогенов, вызывающих инфекции дыхательных путей, с помощью многоканальной петлевой изотермической амплификации (LAMP). LAMP является чувствительным и специфичным диагностическим инструментом, который быстро обнаруживает бактериальные нуклеиновые кислоты с высокой точностью и надежностью. Предложенный метод имеет значительное преимущество по сравнению с традиционными методами культивирования бактерий, которые являются трудоемкими и часто требуют большей чувствительности для обнаружения низких уровней бактериальных нуклеиновых кислот. В данной статье представлены репрезентативные результаты инфекции K. pneumoniae и ее множественных сопутствующих инфекций с использованием LAMP для обнаружения образцов (мокроты, жидкости бронхиального лаважа и жидкости альвеолярного лаважа) из нижних дыхательных путей. Таким образом, многоканальный метод LAMP обеспечивает быстрые и эффективные средства идентификации одиночных и множественных бактериальных патогенов в клинических образцах, что может помочь предотвратить распространение бактериальных патогенов и помочь в надлежащем лечении ИРТ.
Introduction
Инфекции дыхательных путей (ИТР), вызываемые бактериальными патогенами, в первую очередь способствуют заболеваемости и смертности во всем мире1. Он определяется как любые симптомы верхних или нижних дыхательных путей, сопровождающиеся лихорадкой продолжительностью 2-3 дня. В то время как инфекции верхних дыхательных путей встречаются чаще, чем инфекции нижних дыхательных путей, хронические и рецидивирующие инфекции дыхательных путей также являются распространенными клиническими состояниями, представляющими большой риск для людей и создающими значительную нагрузку на системы здравоохранения2. К распространенным бактериальным патогенам РТИ относятся Streptococcus pneumoniae3, Haemophilus influenzae4, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia и другие. Эти патогенные бактерии обычно колонизируют слизистые поверхности носоглотки и верхних дыхательных путей хозяина, вызывая типичные симптомы ИРТ, такие как боль в горле и бронхит. Они вызывают пневмонию, когда распространяются из верхних дыхательных путей в стерильные участки нижних дыхательных путей и могут передаваться от человека к человеку через дыхательные пути5. В тяжелых случаях они также могут приводить к инвазивным бактериальным заболеваниям, особенно к бактериемической пневмонии, менингиту и сепсису, которые являются основными причинами заболеваемости и смертности среди людей всех возрастных групп во всем мире.
Традиционные тесты на RTI включают микробиологическое культивирование с использованием мазков из горла и образцов мокроты из дыхательных путей6. Кроме того, серологические тесты, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), обнаруживают антитела или антигены в сыворотке крови, в то время как тесты на агглютинацию наблюдают за реакцией агглютинации антител и антигенов для выявления инфекции7. Микробное бактериологическое исследование считается золотым стандартом для диагностики ИОТ, но его низкий уровень положительности культуры, низкая надежность и длительный цикл обнаружения ограничивают эффективность диагностики. На самом деле, быстрая и точная диагностика ДП имеет решающее значение для точной эрадикации бактериального патогена. Быстрые и эффективные методы обнаружения могут помочь снизить скорость передачи патогенов, сократить продолжительность инфекции и уменьшить ненужное использование антибиотиков 9,10. Методы, основанные на молекулярной биологии, значительно ускоряют обнаружение, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая усиливает последовательность ДНК целевого гена для обнаружения патогенов. Однако традиционная ПЦР требует сложного оборудования для температурного цикла, которое является громоздким и трудоемким. Кроме того, каждая амплификация ДНК с помощью ПЦР (за исключением ПЦР в реальном времени) заканчивается электрофоретическим разделением продукта, что также требует времени. Для визуализации продукта требуются красители, многие из которых являются мутагенными или канцерогенными. Поэтому крайне важно постоянно разрабатывать новые методы и технологии диагностики бактериальных патогенов РТИ.
Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) является новой и развивающейся молекулярной технологией, первоначально разработанной Notomi et al. в 2000году. LAMP может амплифицировать ДНК в стабильных изотермических условиях без сложного оборудования для температурного цикла, что делает его пригодным для быстрого обнаружения и снижает сложность и стоимость оборудования12. LAMP может обнаруживать низкие концентрации целевой ДНК с высокойчувствительностью13. Он использует несколько специфических праймеров для улучшения селективности по целевым последовательностям и снижения вероятности ложных срабатываний14. LAMP постепенно получает широкое распространение в клинических лабораториях благодаря своей простоте, скорости и интуитивно понятному управлению даже для обнаружения RTI. В этом исследовании мы изучили эффективность LAMP в выявлении более низких RTI в клинических образцах (мокрота, жидкость бронхиального лаважа и жидкость альвеолярного лаважа), как показано на рисунке 1. Очевидно, что LAMP обладает такими преимуществами, как скорость, чувствительность и простота использования по сравнению с традиционными тестами при обнаружении более низкого RTI, что делает его многообещающим приложением.
Рисунок 1: Схематическое изображение метода обнаружения LAMP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Инфекции дыхательных путей являются распространенными внутрибольничными инфекциями, которые влекут за собой тяжелые последствия для пациентов и приводят к росту смертности16. Своевременная и точная идентификация потенциальных патогенов с последующим назначением эффек?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы высоко ценим финансовую поддержку, оказанную Фондом фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований провинции Гуандун (грант No 2022A1515220023) и Научно-исследовательским фондом передовых талантов Народной больницы провинции Гуандун (грант No 2022A. KY012023293).
Materials
| Bath Incubator(MK2000-2) | ALLSHENG | Provide a constant temperature environment | |
| Bronchial lavage fluid collector head | TIANPINGHUACHANG | SEDA 20172081375 | Collecting bronchoalveolar lavage fluid |
| Fiberoptic bronchoscope | OLYMPUS | SEDA 20153062703 | A flexible bronchoscope equipped with a fiberoptic light source and camera, to visually examine the airways and structures within the lungs. Assist in collecting bronchoalveolar lavage |
HR1500- B2 |
Haier | SEDA 20183541642 | Biosafety cabinet |
| NAOH | MACKLIN | S817977 | Liquefy viscous lower respiratory tract sample |
| Nucleic acid detection kit for respiratory tract pathogens | Capitalbio Technology | SEDA 20173401346 | Testing for bacteria infection |
| Nucleic acid extraction reagent | Capitalbio Technology | SEDA 20160034 | For DNA extraction |
| RTisochip-W | Capitalbio Technology | SEDA 20193220539 | Loop-mediated Isothermal Amplification |
| THERMO ST16R | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20180585 | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. |
| Vortex mixer VM-5005 | JOANLAB | For mixing reagent |
References
- GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Infect Dis. 18 (11), 1191-1210 (2018).
- Niederman, M. S., Torres, A. Respiratory infections. Eur Respir Rev. 31 (166), 220150 (2022).
- Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: Transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol. 16 (6), 355-367 (2018).
- Watt, J. P., et al. Burden of disease caused by Haemophilus influenzae type b in children younger than 5 years_ global estimates. Lancet. 374 (9693), 903-911 (2009).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat Rev Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
- Popova, G., Boskovska, K., Arnaudova-Danevska, I., Smilevska-Spasova, O., Jakovska, T. Sputum quality assessment regarding sputum culture for diagnosing lower respiratory tract infections in children. Open Access Maced J Med Sci. 7 (12), 1926-1930 (2019).
- Nuyttens, H., Cyncynatus, C., Renaudin, H., Pereyre, S., Identification Bébéar, C. expression and serological evaluation of the recombinant ATP synthase beta subunit of mycoplasma pneumoniae. BMC Microbiol. 10 (1), 216 (2010).
- Noviello, S., Huang, D. B. The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections. Diagnostics (Basel). 9 (2), 37 (2019).
- Hanson, K. E., et al. Molecular testing for acute respiratory tract infections: Clinical and diagnostic recommendations from the IDSA’s diagnostics committee. Clin Infect Dis. 71 (10), 2744-2751 (2020).
- Daniel Reynolds, J. P. B., et al. The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: Another pandemic. Eur Respir Rev. 31 (166), 220068 (2022).
- T Notomi, H. O., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), 63 (2000).
- Soroka, M., Wasowicz, B., Rymaszewska, A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): The better sibling of PCR. Cells. 10 (8), 1931 (2021).
- Mori, Y., Kitao, M., Tomita, N., Notomi, T. Real-time turbidimetry of lamp reaction for quantifying template DNA. Biophys J. 59 (2), 145-157 (2004).
- Parida, M., Sannarangaiah, S., Dash, P. K., Rao, P. V., Morita, K. Loop mediated isothermal amplification (LAMP): A new generation of innovative gene amplification technique: Perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 18 (6), 407-421 (2008).
- Chinese Medical Association Respiratory Branch Critical Care Medicine Group, Working Committee on Critical Care Medicine of the Chinese Physicians Association Respiratory Physicians Branch. Standardization of collection, submission, testing, and interpretation of bronchoalveolar lavage fluid in ICU patients. Chin J Tubere Respir Dis. 43 (9), 744-756 (2020).
- Koch, A. M., Nilsen, R. M., Eriksen, H. M., Cox, R. J., Harthug, S. Mortality related to hospital-associated infections in a tertiary hospital: Repeated cross-sectional studies between 2004-2011. Antimicrob Resist Infect Control. 4 (1), 57 (2015).
- Seymour, C. W. F. G., et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. N Engl J Med. 376 (23), 2235-2244 (2017).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of candidatus Liberibacter asiaticus: A causal agent of citrus huanglongbing. Plant Pathol. 34 (6), 499-505 (2018).
- Büscher, P., Njiru, Z. K. Loop-mediated isothermal amplification technology: Towards point of care diagnostics. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1572 (2012).
- Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Principle, features, and future prospects. J Microbiol. 53 (1), 1-5 (2015).
- Ajibola, O., Gulumbe, B., Eze, A., Obishakin, E. Tools for detection of schistosomiasis in resource limited settings. Medical Sciences. 6 (2), 39 (2018).
- Kumar, Y. S. B., et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Compr Rev Food Sci Food SAF. 16 (6), 1359-1378 (2017).
- Hongling Ou, Y. W., et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 10 (10), 11053-11066 (2021).
- Liang Wang, J. -. X. L., et al. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based rapid diagnosis of helicobacter pylori infection and antibiotic resistance. J Vis Exp. (197), e65689 (2023).
- Jing-Wen Lyu, B. X., et al. Rapid prediction of multidrug-resistant klebsiella pneumoniae through deep learning analysis of SERS spectra. Microbiol Spectr. 11 (2), e0412622 (2023).
- Wei Liu, J. -. W. T., et al. Discrimination between carbapenem-resistant and carbapenem-sensitive klebsiella pneumoniae strains through computational analysis of surface-enhanced Raman spectra a pilot study. Microbiol Spectr. 10 (1), e0240921 (2022).
- Zhang, L. Y., et al. Classification and prediction of klebsiella pneumoniae strains with different MLST allelic profiles via SERS spectral analysis. Peer J. 11, e16161 (2023).
- Zhi Liu, Q. Z., et al. Rapid and sensitive detection of salmonella in chickens using loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick. J Microbiol Biotechnol. 29 (3), 454-464 (2019).
- Chen, F., et al. Fully Integrated microfluidic platform for multiplexed detection of hunov by a dynamic confined-space-implemented one-pot RPA-LAMP system. Adv Sci (Weinh). 21, e2306612 (2023).
