Detecção rápida de patógenos bacterianos que causam infecções do trato respiratório inferior por meio de amplificação isotérmica mediada por loop baseada em chip microfluídico
Summary
Vários patógenos bacterianos podem causar infecções do trato respiratório e levar a sérios problemas de saúde se não forem detectados com precisão e tratados prontamente. A detecção rápida e precisa desses patógenos por meio de amplificação isotérmica mediada por loop fornece gerenciamento e controle eficazes de infecções do trato respiratório em ambientes clínicos.
Abstract
As infecções do trato respiratório (ITRs) estão entre os problemas mais comuns em ambientes clínicos. A identificação rápida e precisa de patógenos bacterianos fornecerá diretrizes práticas para o gerenciamento e tratamento de ITRs. Este estudo descreve um método para detectar rapidamente patógenos bacterianos que causam infecções do trato respiratório por meio de amplificação isotérmica mediada por loop multicanal (LAMP). O LAMP é uma ferramenta de diagnóstico sensível e específica que detecta rapidamente ácidos nucléicos bacterianos com alta precisão e confiabilidade. O método proposto oferece uma vantagem significativa sobre os métodos tradicionais de cultura bacteriana, que são demorados e muitas vezes requerem maior sensibilidade para detectar baixos níveis de ácidos nucléicos bacterianos. Este artigo apresenta resultados representativos da infecção por K. pneumoniae e suas múltiplas coinfecções usando LAMP para detectar amostras (escarro, lavado brônquico e lavado alveolar) do trato respiratório inferior. Em resumo, o método LAMP multicanal fornece um meio rápido e eficiente de identificar patógenos bacterianos únicos e múltiplos em amostras clínicas, o que pode ajudar a prevenir a disseminação de patógenos bacterianos e auxiliar no tratamento adequado de ITRs.
Introduction
As infecções do trato respiratório (ITRs) causadas por patógenos bacterianos contribuem principalmente para a morbidade e mortalidade em todo o mundo1. É definida como qualquer sintoma respiratório superior ou inferior acompanhado de febre com duração de 2-3 dias. Embora a infecção respiratória superior seja mais comum do que a infecção respiratória inferior, as infecções crônicas e recorrentes do trato respiratório também são condições clínicas comuns, apresentando grandes riscos aos indivíduos e sobrecarregando significativamente os sistemas de saúde2. Os patógenos bacterianos comuns de ITRs incluem Streptococcus pneumoniae3, Haemophilus influenzae4, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia, entre outros. Essas bactérias patogênicas geralmente colonizam as superfícies mucosas da nasofaringe e do trato respiratório superior do hospedeiro, causando sintomas típicos de ITRs, como dor de garganta e bronquite. Causam pneumonia quando se espalham do trato respiratório superior para áreas estéreis do trato respiratório inferior e podem se espalhar de pessoa para pessoa através do trato respiratório5. Em casos graves, eles também podem levar a doenças bacterianas invasivas, especialmente pneumonia bacterêmica, meningite e sepse, que são as principais causas de morbidade e mortalidade em pessoas de todas as faixas etárias em todo o mundo.
Os testes tradicionais para ITRs envolvem cultura microbiológica usando swabs de garganta e amostras respiratórias de escarro6. Além disso, testes sorológicos, como ensaio imunoenzimático (ELISA), detectam anticorpos ou antígenos no soro, enquanto os testes de aglutinação observam a reação de aglutinação de anticorpos e antígenos para detectar infecção7. A cultura microbiana é considerada o padrão-ouro para o diagnóstico de ITRs, mas sua baixa taxa de positividade da cultura, baixa confiabilidade e longo ciclo de detecção limitam a eficiência diagnóstica8. Na realidade, o diagnóstico rápido e preciso de ITRs é crucial para a erradicação precisa do patógeno bacteriano. Métodos de detecção rápidos e eficazes podem ajudar a reduzir a taxa de transmissão de patógenos, encurtar a duração da infecção e diminuir o uso desnecessário de antibióticos 9,10. Métodos baseados em biologia molecular aceleram significativamente a detecção, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), que amplifica a sequência de DNA de um gene-alvo para detectar patógenos. No entanto, a PCR tradicional requer equipamentos complexos de ciclagem de temperatura, que são pesados e demorados. Além disso, toda amplificação de DNA usando PCR (exceto PCR em tempo real) termina com a separação eletroforética do produto, o que também leva tempo. A visualização do produto requer corantes, muitos dos quais são mutagênicos ou cancerígenos. Portanto, é imperativo desenvolver continuamente novos métodos e tecnologias para diagnosticar patógenos bacterianos RTI.
A Amplificação Isotérmica Mediada por Loop (LAMP) é uma tecnologia molecular nova e emergente inicialmente desenvolvida por Notomi et al. em 200011. O LAMP pode amplificar o DNA sob condições isotérmicas estáveis sem equipamentos complexos de ciclagem de temperatura, o que o torna adequado para detecção rápida e reduz a complexidade e o custo do equipamento12. O LAMP pode detectar baixas concentrações de DNA alvo com alta sensibilidade13. Ele usa vários primers específicos para melhorar a seletividade das sequências-alvo e reduzir a possibilidade de falsos positivos14. O LAMP está sendo gradualmente amplamente utilizado em laboratórios clínicos devido à sua facilidade, velocidade e operação intuitiva, mesmo para detectar RTIs. Neste estudo, investigamos a eficácia do LAMP na detecção de ATRs inferiores em amostras clínicas (escarro, lavado brônquico e lavado alveolar), conforme mostrado na Figura 1. É evidente que o LAMP oferece vantagens como velocidade, sensibilidade e facilidade de uso em relação aos testes tradicionais na detecção de RTI mais baixa, tornando-o uma aplicação promissora.
Figura 1: Ilustração esquemática do método de detecção LAMP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
As infecções do trato respiratório são infecções hospitalares prevalentes, impondo graves consequências aos pacientes e aumentando as taxas de mortalidade16. A identificação oportuna e precisa de patógenos potenciais seguidos de antibióticos eficazes é a chave para o sucesso do tratamento e a melhoria do prognóstico, principalmente devido às limitações inerentes aos métodos tradicionaisde cultura 17. Neste estudo, usamos um método baseado em LAMP para dete…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos muito o apoio financeiro fornecido pela Fundação de Pesquisa Básica e Aplicada de Guangdong (Concessão nº 2022A1515220023) e pela Fundação de Pesquisa para Talentos Avançados do Hospital Popular da Província de Guandong (Concessão nº. KY012023293).
Materials
| Bath Incubator(MK2000-2) | ALLSHENG | Provide a constant temperature environment | |
| Bronchial lavage fluid collector head | TIANPINGHUACHANG | SEDA 20172081375 | Collecting bronchoalveolar lavage fluid |
| Fiberoptic bronchoscope | OLYMPUS | SEDA 20153062703 | A flexible bronchoscope equipped with a fiberoptic light source and camera, to visually examine the airways and structures within the lungs. Assist in collecting bronchoalveolar lavage |
HR1500- B2 |
Haier | SEDA 20183541642 | Biosafety cabinet |
| NAOH | MACKLIN | S817977 | Liquefy viscous lower respiratory tract sample |
| Nucleic acid detection kit for respiratory tract pathogens | Capitalbio Technology | SEDA 20173401346 | Testing for bacteria infection |
| Nucleic acid extraction reagent | Capitalbio Technology | SEDA 20160034 | For DNA extraction |
| RTisochip-W | Capitalbio Technology | SEDA 20193220539 | Loop-mediated Isothermal Amplification |
| THERMO ST16R | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20180585 | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. |
| Vortex mixer VM-5005 | JOANLAB | For mixing reagent |
References
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